1、第2章酶分析，第1節(jié)酶分析的基本知識，1.1兩種酶分析，1.2酶分析的特征，1.3酶分析的意義，第2章酶分析，第1節(jié)酶分析的基本知識，第2節(jié)酶活性的測定，第3節(jié)酶分析，第4節(jié)酶循環(huán)分析，第5節(jié)固定化酶在酶分析中的應用。具有蛋白質性質的酶是高效、高特異性的生物催化劑，與生命活動密切相關。因此，酶學在生產實踐的基礎理論研究中起著非常重要的作用。酶分析法是重要內容之一，也是目前發(fā)展迅速的一個領域。酶的選擇性及其在低濃度下催化底物反應的能力對化學分析非常有用。酶促反應已被用于測定底物、活化劑、抑制劑和酶。在19世紀中葉，酶被用來測定糖類。20世紀40年代初，沃伯格提出了一種基于還原型輔酶的測定NAD和

2、NADP的分光光度法。最新進展是電化學方法和熒光方法的應用。酶分析已經成為公認的分析技術。1.1酶分析的兩種類型是：以酶為分析對象，根據需要測量樣品中的酶含量或活性，這通常稱為“酶活性測量”。另一種方法是用酶作為分析試劑，測定樣品中用一般化學方法難以檢測的物質，如酶的底物、抑制劑、激活劑和輔因子，一般稱為“酶分析法”。雖然這兩種方法的檢測對象不同，但其原理和方法都是基于酶能夠特異、高效地催化化學反應，通過測量酶的反應速度可以檢測相應物質的含量。有必要選擇合適的反應條件和測定方法。1.2酶分析的特征選擇性高。原則上，一種酶只能催化一種反應，或者只能催化一種特定的化合物或作用于特定的化學鍵。這是由

3、酶本身的高度特異性決定的。高靈敏度。一般可達10-7毫升/升.結合熒光法，最高可達10-9mol/L.反應速度快，條件溫和。大多數酶促反應可以在30分鐘內完成。反應條件溫和，例如在常溫、常壓和接近中性的酸堿度下，反應速度非?？臁Ｃ傅牧亢苌伲院芙洕?。精確度一般。主要是由于微量移液器的誤差，如量低于1ul，取樣誤差較大。這也與組合方式有關。適用范圍有一定的限制。僅測定酶、底物、輔酶、激活劑或抑制劑。簡單程度很差。有必要進行酶學知識的操作培訓，這通常需要最大限度地減少人為錯誤并使所有反應系統(tǒng)條件盡可能一致。例如樣品添加、溫度、反應時間等。要求準確。確定最佳反應條件(如溫度、酸堿度等)非常重要。)

4、。一個熟練的酶學家會考慮各種因素，設計的實驗是合理的和可重復的；沒有受過特殊訓練的人容易犯錯誤。1.3酶分析的意義酶的應用大致可分為四個方面：(1)制造某些產品；(2)去除某些物質；(3)鑒定化合物；(4)確定物質。(1)和(2)被廣泛使用。例如，可的松由酶法生產，奶酪由凝乳酶生產，果汁由果膠酶澄清。(3)和(4)屬于酶分析的范疇。酶分析迅速發(fā)展的原因之一是，由于酶制劑工業(yè)的發(fā)展，可以容易地獲得各種酶制劑。第二個原因是由于酶應用形式的發(fā)展。由于近十年來酶固定化技術的快速發(fā)展，酶的重復和連續(xù)使用成為可能。固定化酶有很多種。一方面，它們與自動測定技術相結合，促進了自動酶分析的快速普及。另一方面，它

5、正在被進一步簡化，或者它可以被制成含有酶的試紙或制成酶試劑包裝出售，可以直接使用例如，用葡萄糖氧化酶(EC1134)測定血糖是臨床檢查中常用的方法，某些酶的測定也是臨床診斷的重要指標。在第二節(jié)中，酶活性的測定，2.1酶活性單位和初始反應速度，2.2反應條件的測定，2.3測定方法，1酶活性的概念，2.1酶活性單位和初始反應速度，2.1.1酶量通常用酶活性單位表示。酶活單位是指在一定條件下使酶反應達到一定速度所需的酶量。酶含量可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑的酶單位數來表示。1959年，國際生物化學協(xié)會酶委員會接受了拉克的建議，采用“國際單位”來表示酶的活性。國際單位：25，最佳酸堿度，最佳底物濃度

6、，每分鐘催化1L底物反應的酶量。當底物是蛋白質、多糖等時。包括可被酶作用的多個鍵或基團，酶單元可通過催化作用的基團或鍵的微小變化來表達；對于反應來說，酶單位可以通過兩微摩爾的來計算.1972年，酶委員會提出了一個新的單位Katal。在確定的最佳反應條件下，每秒鐘催化1摩爾底物變化所需的酶量為1Kat。1Kat=60106IU .在實際工作中，為了簡單起見，人們經常使用自己習慣的單位。有時它甚至可以直接用測量的物理量來表示。例如，酶單位表示為光吸收的變化值。當估計酶制劑的純度時，使用比活性，也就是說，當酶是高純度的并且酶的分子量和每個酶分子上的活性中心的數量已知時，它可以用分子活性或轉化率(TN

7、)來表示。TN代表在最佳條件下每分鐘每種酶分子或活性中心的催化底物分子(或相關基團)的數量。這個單位的意思是，它可以用來估計和比較酶的催化效率。2.1.2初始反應速度酶促反應速度可以用單位時間內底物的減少或產物的增加來表示?！懊阜磻M程曲線”可以通過繪制產物或底物相對于時間的變化來獲得，該曲線的斜率代表酶反應速度。酶活性測定的目的是通過測量酶的反應速度來獲得酶的濃度或含量。測得的反應速度和酶濃度之間必須存在線性比例關系，這是檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否合適和正確的標準。2.2反應條件的確定選擇反應條件的基本要求是所有待測的酶分子應能正常工作。也就是說，在反應體系中，除了待測酶的濃度是影響反應速度的

8、唯一因素外，其他因素都應處于最佳條件。2.2.1基材(包括合成基材)在物理和化學性質上最好不同于產品。一些底物和產物在酶的作用下具有這樣的特性，如脫氫酶的NAD(P)和NAD(P)H；另一些需要處理色源或熒光源的底物，產品在酶作用后會產生顏色或熒光。例如，對硝基苯磷酸可用于磷酸酶測定。底物濃度為了使酶的反應速度不受其限制，反應體系應使用足夠高的底物濃度。標準是Km，例如，s=100Km，因為在這種情況下反應速度可以達到最大速度的99%。大多數酶具有相對特異性。通常，在可被其作用的各種底物中，選擇具有小Km的底物作為測定的底物。當底物表現(xiàn)出高底物濃度抑制，或具有低溶解度，或毒性，或使用高濃度太昂

9、貴，且沒有其它合適的底物可替代時，只能根據具體條件選擇合適的底物濃度。并測定了該濃度下酶反應的動力學水平。例如，酵母中的蔗糖受到高蔗糖濃度的抑制，因此通常選擇蔗糖濃度約為5%進行測定，并且反應是零級的。2.例如，乳酸脫氫酶的反應在pH 7時向乳酸形成方向發(fā)展，在pH10時傾向于形成丙酮酸。在測定酶活性時，應注意選擇合適的反應酸堿度，并將反應保持在此范圍內。某些酶反應的最佳酸堿度可能會因反應溫度和底物濃度而異。例如，堿性磷酸酶在25、30和37時的最適酸堿度分別為10.3、10.1和9.9。酶反應緩沖體系中離子的pK值應接近待調節(jié)的酸堿度。磷酸鹽緩沖液適用于酸堿度低于7.5的反應體系，Tris緩

10、沖液適用于酸堿度高于7.5的反應體系。甘氨酸-甘氨酸二肽在pH8時是一個很好的緩沖體系。不同的緩沖離子可能影響酶的活性水平，甚至最適的酸堿度。緩沖離子也可能與酶活性的主要成分形成復合物，導致酶活性的抑制。例如，磷酸可以與多價陽離子如Ca2結合，硼酸可以與各種有機化合物如呼吸鏈中間體結合，從而抑制相應的酶活性。2.2.3溫度直接影響化學反應本身的速度、酶的穩(wěn)定性、酶的構象和酶的催化機理。如果溫度變化1，速度差異可能超過10。為了獲得高度可重復的結果，溫度變化應控制在0.1以內。1961年，生化協(xié)會建議將酶的反應溫度定為25，1964年又建議改為30；國際臨床化學聯(lián)合會也推薦30種。然而，許多臨床

11、化學家經常使用37作為酶反應溫度。2.2.4輔因子一些酶需要金屬離子，而另一些需要相應的輔酶物質。在反應體系中，我們要滿足酶對這些輔因子的需求，在添加這些物質時也要注意它們的特異性，有些激活劑在高濃度下可能有抑制作用。為了提高酶在反應體系中的穩(wěn)定性，有時需要一些相應的物質。例如，巰基乙醇、二硫蘇糖醇等可以加入到巰基酶中。為了防止待測酶在樣品制備和反應過程中被蛋白酶降解，通常添加蛋白酶抑制劑。2.2.5樣品許多待測樣品通常包含各種干擾因素，例如可能作用于同一底物或產品的其他酶。因此，在確定之前，有必要檢查系統(tǒng)中是否存在這些干擾因素。同時，采用不同的測定方法，同時檢測底物和產物的變化，然后觀察測定

12、結果是否一致。通過這些比較分析，確定是否存在干擾。GPT或GOT可以催化氨基的轉移。該測定方法與脫氫酶反應相結合。前者可與乳酸脫氫酶(LDH)偶聯(lián)，后者可與蘋果酸脫氫酶(MDH)偶聯(lián)，然后測量反應過程中340納米處NADH光吸收的減少。在這些樣品中，如果含有谷氨酸脫氫酶(GluDH)，可能會發(fā)生干擾。反應平衡趨向于形成左旋谷氨酸，這也導致在340納米處光吸收的減少。葡萄糖脫氫酶在正常血清中很少見，但在腦、肝和其他組織中極其豐富。在某些病理條件下，血清中這種酶的活性可能顯著增加。酶反應需要NH4，其Km非常大。如果反應體系可以避免NH4，這種干擾可以消除。同時，進行了空白試驗。2.2.6空白和對

13、照空白是指由混雜反應和自發(fā)反應引起的變化，提供未知因素的影響。空白值可以通過不添加酶、底物或兩者都添加的反應系統(tǒng)獲得，但是酶是預先失效的。對照是指用純酶或標準酶制劑測定的結果，主要用作比較或校準的標準。2.3測定方法測量方法包括取樣法和連續(xù)法。取樣方法：在酶反應開始后的不同時間從反應體系中取出一定量的反應溶液，用適當的方法停止反應，然后分析產物和底物的化學性質，得到單位時間內酶反應的變化量。連續(xù)法：基于th2.3.1光吸收測量是一種基于產品和基質在某一波長或波段的明顯特征吸收差異的連續(xù)觀察方法。光學吸收測量被廣泛使用。幾乎所有的氧化還原酶都可以用這種方法測定。實施例1:脫氫酶的輔酶NAD(P)

14、H在340納米處有吸收峰，但氧化形式沒有。實施例2:細胞色素氧化酶的底物是細胞色素c，其在550納米處的吸收系數在還原狀態(tài)下為2.81104厘米/摩爾，在氧化狀態(tài)下為0.80104厘米/摩爾。這種光吸收的差異也可用于測定。一些氧化還原酶很難獲得天然供體和受體，因此可以使用簡單的人工供體和受體(見下表)。這可以通過光吸收來確定-還有那些催化雙鍵飽和或雙鍵形成的酶反應，以及那些催化環(huán)狀結構變化的酶反應。實施例1:富馬酸酶催化反應，富馬酸在300納米處有很強的光吸收，而蘋果酸沒有。實施例2:尿酸氧化酶催化尿酸氧化成尿囊素。尿酸在290納米處被吸收，但尿囊素不被吸收。光吸收法的特點是靈敏度高(可以檢測

15、到nmol/L水平的變化)，簡單易行，一般可在短時間內完成測定。光吸收法被廣泛使用。除上述氧化還原酶外，還有許多激酶(轉移酶)、酯酶、肽酶等。在這種方法中被廣泛使用。2.3.2熒光分析如果酶反應的底物或產物具有熒光，熒光強度的變化率可用作酶反應速度的量度。用這種方法可以測定兩種酶反應：一種是脫氫酶反應，另一種是其他反應，它們的底物在酶反應過程中有熒光變化。例如，NAD(磷)氫的中性溶液發(fā)出強烈的藍白色熒光(460納米)，而NAD(磷)不發(fā)出。另一種是使用熒光源底物的酶反應。例如，脂肪酶可由二丁基熒光素測定，二丁基熒光素不發(fā)熒光，但水解后釋放熒光素。熒光分析的優(yōu)點：其靈敏度比光吸收分析高23個數

16、量級，特別適合于酶或底物量極低時的快速酶分析。與此相關的是熒光光譜和熒光偏振測量。近年來，它們被廣泛用于研究酶的作用機理。熒光測量的缺點熒光讀數和濃度之間沒有正比關系。而且往往是由于溫度、散射、儀器等測定條件。因此，如果你想用一個確定的單位來表示酶的活性，你應該首先準備一個校準曲線，然后根據這個曲線精確地量化它。這種方法容易受到其他物質的干擾。重鉻酸鉀等物質經常會奪取能量并降低熒光強度；有些物質，如蛋白質，可以吸收和發(fā)射熒光，這種干擾在紫外區(qū)特別明顯，所以最好用可見光測量熒光，特別是紅色熒光。2.3.3電化學方法具有較高的靈敏度和準確度，可與光學方法相比。測量系統(tǒng)中有一些物質，不會影響結果。這

17、種方法需要一定的儀器和設備。最常見的離子選擇電極法是用玻璃電極測量酸度的變化?？捎糜诋a酸反應的測定。這種方法操作簡單，但有兩個缺點：第一，隨著反應的進行，酸堿度會不斷變化，酶的活性也會變化；其次，測量系統(tǒng)的酸堿度取決于介質的緩沖能力，而蛋白質是一種高緩沖物質，待測的粗樣品往往含有大量的惰性蛋白質，因此很難保證恒定的緩沖強度，測量結果也很難準確。連續(xù)滴定或恒酸滴定可以克服上述困難。所謂恒酸滴定是指在反應過程中，不斷向反應體系中加入酸或堿以保持酸堿度恒定，反應速度由加入酸或堿的速率來表示。恒酸滴定儀就是為滿足這一需求而設計的一種精密測量儀器。它能自動加入酸和堿來控制酸堿度，并記錄下反應時間可以進行選擇