1、1、第十一章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，講師：生科院洪軍，2，制藥微生物生產(chǎn)菌種如何選育？發(fā)酵中主要檢測(cè)出的殘奧表是什么？ 發(fā)酵過(guò)程是如何控制的？ 知識(shí)回顧，3，主要內(nèi)容，抗生素概述：(1)抗生素的定義(2)抗生素的命名(3)抗生素分類青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)： (重點(diǎn)) (1)青霉素的概述(2)生產(chǎn)菌的生物科學(xué)特性(2)因此，抗生素(antibiotics )是微生物在代謝過(guò)程中濃度低由于抗生素的這種殺菌能力，我們?cè)?jīng)稱這種物質(zhì)為抗生素。 5、目前：源：隨著抗生素的研究和生產(chǎn)的發(fā)展，新的抗生素源不斷擴(kuò)大。 微生物、植物(例如，大蒜素、常山鹽化學(xué)基、黃連素、長(zhǎng)春花鹽化學(xué)基、魚(yú)腥草素等)、動(dòng)物(例如，魚(yú)素、

2、血紅細(xì)胞素等)。 然而，抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是來(lái)自微生物的大量發(fā)酵法，微生物是抗生素舞臺(tái)上的主角。 作用對(duì)象：細(xì)小病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、藻類、腫瘤細(xì)胞球等。 抗生素不能作為抗微生物劑使用。 6、定義：抗生素使用廣泛，但由于抗生素的多樣性，對(duì)抗生素的定義在專門(mén)人才中一直存在分歧。 目前，大多數(shù)專門(mén)人才所接受的定義是，抗生素是在生物(包括某些微生物、植物、動(dòng)物)的生命活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的，或者是(由化學(xué)合成得到的)低濃度、能選擇性抑制其他生物功能的低分子量有機(jī)物。 狹義的定義是，抗生素是低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，低濃度能抑制其他微生物的生長(zhǎng)。 7、按生物來(lái)源：動(dòng)物、植物、微生物所產(chǎn)生的

3、，可按來(lái)源命名。 如青霉素、赤霉素、大蒜素由化學(xué)結(jié)構(gòu)命名：化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)清晰，如抗四環(huán)素(包括并四苯的基本母核)、氯抗四環(huán)素(多氧注音字素)、氧抗四環(huán)素(赤霉素)。 其他：紀(jì)念意義、產(chǎn)地、俗名，如正定霉菌、井岡霉菌、毒注音字素和赤霉素等。 (2)抗生素命名(一般分為三種)，8、北環(huán)(natural penicillin R=、CH2-CO-、9、-內(nèi)酰胺環(huán)、苯并異惡唑啉、氨基苯偶酰青霉素1958年6月3日，最大的抗生素聯(lián)合企業(yè)(華北制藥廠、石家莊)完成生產(chǎn)現(xiàn)在原料藥基地很多。 但是，在半合成及制品藥的劑型方面與國(guó)外相比有很大差異。11、抗生素濫用的災(zāi)區(qū)，中國(guó)是抗生素使用大國(guó)，也是抗生素生產(chǎn)大國(guó)：

4、年產(chǎn)抗生素原料約21萬(wàn)噸，出口3萬(wàn)噸，其自用(包括醫(yī)療和農(nóng)業(yè)使用)，人均年消費(fèi)量138克左右(美國(guó)只有13克)。 2011年4月7日是世界衛(wèi)生日，首次合理用藥大會(huì)當(dāng)天召開(kāi)，正好符合世界衛(wèi)生日的主題“耐藥性：今天不采取行動(dòng)，明天就沒(méi)有藥”。 12、“后抗生素時(shí)代”，如果不特羅爾整抗生素的濫用狀態(tài)，二十一世紀(jì)的人類就有可能失去抗生素這一有利的治療武器，再次回到?jīng)]有抗生素的時(shí)代，即所謂的“后抗生素時(shí)代”。 后抗生素時(shí)代正在倒退，藥物有可能回到不可用狀態(tài)，大量的傳染性疾病危害人類健康和生命。 這是悲觀的思維方法，悲觀是有道理的，細(xì)菌的耐藥性遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于新藥物開(kāi)發(fā)的速度，這是確實(shí)的現(xiàn)象。、13，3抗生素的分

5、類可以從生物來(lái)源、作用對(duì)象、化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、生物合成路線等方面分類抗生素。 3.1抗生素的生物來(lái)源分類(生物學(xué)家) (1)放線菌產(chǎn)生的抗生素：例如鏈霉素、四環(huán)類(例如抗四環(huán)素)、宏命令內(nèi)酯類(例如赤蘚紅)、聚乙烯管類(例如抑制霉菌素)、放線菌素類(例如放線菌素d )等。 (其中鏈霉菌屬最多，去甲霉素屬，孢霉素次) (2)真菌產(chǎn)生的抗生素：如青霉屬和頭孢菌素屬等分別產(chǎn)生重要的抗生素(青霉素、紅霉素、頭孢菌素)。 (14 )細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：如多粘菌、納豆菌、芽胞桿菌等。 例如，多粘菌。 (4)植物或動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素：從被子植物的大蒜中獲得的大蒜素動(dòng)物的器官制造的釣魚(yú)式攻擊等。 3.2根據(jù)抗生

6、素的作用對(duì)象進(jìn)行分類(醫(yī)生，病理學(xué)家) (1)廣譜抗生素：如阿摩尼亞薄板青霉素抑制g、G- (2)抑制抗g的抗生素：如青霉素、(3)抗G-的抗生素：如鏈霉素(3)抗(5)抗癌抗生素：如阿維菌素3.3根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(化學(xué)家)復(fù)雜、目前確定結(jié)構(gòu)的抗生素習(xí)慣分為以下幾類： (1)內(nèi)酰胺類抗生素：包括青霉素類的頭孢菌素類等；(2)氨基糖苷類抗生素：包括鏈霉素、慶大霉素等；(3) 大環(huán)內(nèi)脂類抗生素：如紅霉素、萬(wàn)古霉素(4)四環(huán)類抗生素：如抗四環(huán)素、赤霉素(5)多肽類抗生素：如多粘菌、多肽3.4作用機(jī)制分類該分類優(yōu)點(diǎn)：易于進(jìn)行理論研究，有助于理解抗生素影響病原體新陳代謝的環(huán)節(jié)(1)抑制細(xì)胞貼壁合

7、成的抗生素：青霉素等。 (2)影響胞質(zhì)膜功能的抗生素：多烯類抗生素。 (3)抑制致病菌蛋白質(zhì)合成的抗生素：抗四環(huán)素。 (4)抑制核酸合成的抗生素：如影響DNA結(jié)構(gòu)和功能的絲裂霉素c。 (5)抑制生物能作用的抗生素：如抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素。 (1)根據(jù)氨基酸、肽類誘導(dǎo)體抗生素對(duì)17，18，3.5抗生素的合成路線分類低聚肽抗生素，如青霉素類、頭孢菌素等。 (2)糖類誘導(dǎo)體抗生素：如鏈霉素等糖苷類抗生素。 (3)冰乙酸、丙酸單位的誘導(dǎo)體抗生素：紅細(xì)胞吉卜賽人素等丙酸誘導(dǎo)體。 19、生產(chǎn)方法： 1、生物合成法：傳統(tǒng)方法“工程菌”制造法細(xì)胞融合技術(shù)法2、化學(xué)合成法3、生物合成加化學(xué)合成法。 4抗生素生產(chǎn)

8、工藝，20，1，生物合成法：傳統(tǒng)方法多來(lái)源于放線菌和霉菌。 菌種是從土壤中分離、篩選而得，采用深層換氣攪拌發(fā)酵槽生產(chǎn)。 由于傳統(tǒng)方法目前存在諸多不足，人們采用基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)，改造、重新修訂抗生素產(chǎn)生菌，不僅可以制造許多高效低毒的新型抗生素，而且可以改革技術(shù)，使抗生素產(chǎn)量加倍。 21、“工程菌”制造法首次從“工程菌”制造的新抗生素馬迪視紫質(zhì)a，在美國(guó)有報(bào)道。 他們將部分產(chǎn)生視紫質(zhì)的基因插入產(chǎn)生麥迪遜的放線菌中，并通過(guò)建構(gòu)得到的“工程菌”產(chǎn)生新的抗生素。 我國(guó)新建構(gòu)的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，都是將?；复呋瘎┗蚩寺?fù)制到卡那霉素產(chǎn)生菌后得到的。 新“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小

9、，對(duì)卡那霉素、慶大霉素致病菌的臨床治療效果顯著。 22、細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)抗生素產(chǎn)生菌采用細(xì)胞融合技術(shù)的效果更顯著。橄欖色孢霉素細(xì)胞融合株的抗生素生產(chǎn)率比原菌株提高了140倍。 目前，DNA重組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于赤霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種，近期將有更多的“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問(wèn)世。23、2、化學(xué)合成法可根據(jù)某些抗生素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，采用化學(xué)合成的方法，生產(chǎn)部分抗生素。 例如，氯霉素、磷霉素等。 經(jīng)過(guò)化學(xué)合成方法和控制條件的研究，越來(lái)越多的抗生素可以用化學(xué)合成法生產(chǎn)。 24，3，生物合成化學(xué)合成法的許多細(xì)菌逐漸出現(xiàn)藥物耐受力，已證實(shí)某些耐藥因子位于細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)?？稍诩?xì)菌間轉(zhuǎn)移，結(jié)

10、果導(dǎo)致藥物耐受力越來(lái)越多，抗生素療效越來(lái)越低。 為了應(yīng)對(duì)細(xì)菌的藥劑耐受力，科學(xué)家對(duì)傳統(tǒng)的抗生素進(jìn)行了“整形手術(shù)”，細(xì)菌由于無(wú)法識(shí)別經(jīng)過(guò)修飾的抗生素而被抑制或殺害。 使用克隆復(fù)制了?；复呋瘎┗虻摹肮こ叹?大腸菌群)可以有效地生產(chǎn)半合成抗生素。 臨床上使用的珍貴特效藥物頭孢菌素(頭孢菌素類)、氨西林就是這種半合成抗生素類藥物。 國(guó)外已有數(shù)十種此類藥物在實(shí)驗(yàn)室研究開(kāi)發(fā)成功。 25、抗生素制備的一般程序流程圖、菌種孢子制備發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制產(chǎn)品檢驗(yàn)、發(fā)酵階段、提取階段、產(chǎn)品外包裝、5青霉素概要、26、27、 易溶于水，游離酸易溶于醇、酮、醚、酯類化合物等一般有機(jī)溶劑。 游離酸和鹽類

11、的水溶液都不穩(wěn)定，容易失去抗菌效果。 不耐熱，一般保存在冰箱中，青霉素鹽的結(jié)晶純品，在干燥條件下可以在室溫下進(jìn)行三年五載保存。 青霉素的抗菌效果與其分子中的內(nèi)酰胺環(huán)有關(guān)。28、抗菌作用和臨床應(yīng)用，青霉素主要抑制g菌，而對(duì)某些g菌、螺旋體及放線菌也具有較強(qiáng)的抗菌作用，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞貼壁合成有關(guān). 青霉素臨床上用于治療葡萄球菌感染，如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，用于溶血性鏈球菌感染，如腹膜炎、產(chǎn)褥熱、肺炎、淋病、梅毒、炭疽病毒等。29、菌種：黃青霉的生長(zhǎng)發(fā)育可分為7個(gè)階段：期：菌絲生長(zhǎng)期，適于制種期：青霉素分泌細(xì)胞期：假菌絲自溶期。5.1青霉素生產(chǎn)菌特性、點(diǎn)青霉、30青霉素生產(chǎn)菌生長(zhǎng)過(guò)程

12、、分生孢子萌發(fā)期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少、小空孢子大空胞自溶解、菌絲生長(zhǎng)期、青霉素分泌細(xì)胞期、菌絲自溶解期第2期：菌絲繁殖、嗜鹽化學(xué)基性、類脂肪小粒子。 第三期：脂肪包涵體、儲(chǔ)藏物、嗜鹽化學(xué)基性強(qiáng)。 第4期：空泡、嗜鹽化學(xué)基性減弱，開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。 第5期：大空泡、中性染色大顆粒、脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第6期：個(gè)別細(xì)胞球自行溶解，細(xì)胞球內(nèi)無(wú)顆粒，釋放阿摩尼亞，pH升高。 第7期：菌絲完全自溶，只有空細(xì)胞貼壁。 發(fā)酵培養(yǎng)下生長(zhǎng)過(guò)程和細(xì)胞學(xué)變化，鏡檢控制規(guī)定時(shí)間采樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的物態(tài)變化，發(fā)酵控制。 14期為菌絲生長(zhǎng)期，3期菌體適于種子。 45期是生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，

13、通過(guò)工程措施，延長(zhǎng)這個(gè)期，獲得高產(chǎn)。 在第六期到來(lái)之前完成發(fā)酵。 準(zhǔn)備了補(bǔ)充劑、工藝、6.1青霉素生產(chǎn)工藝、鑄造模型、種子罐1和2、米孢子、預(yù)處理罐、過(guò)濾煙嘴、發(fā)酵罐、萃取器、蒸發(fā)器、工業(yè)鹽、提取、工藝、工藝、冷凍干燥瓊脂斜面搖鏡頭種培養(yǎng)基再次傳遞斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。 米孢子：應(yīng)移植到小米或米固體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)7天，注意25 :每批孢子進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。 6.2青霉素發(fā)酵工藝，(2)，種子罐培養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子發(fā)芽，形成菌絲。 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣元素、玉米油、防沫劑等。 空氣產(chǎn)水量1:3 (體積比)； 以300-350rpm為一盞茶攪

14、拌pH值自然、溫度271、40h二級(jí)種子箱：繁殖箱、大量繁殖。 接種量10培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米淀粉、玉米油、防沫劑等。 氣流量1:1-1.5； 攪拌250-280rpm； pH自然，251。 10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗，期，倍增期6-8h，(3)，生產(chǎn)罐培養(yǎng)技術(shù)三級(jí)罐：生產(chǎn)罐。 接種量20培養(yǎng)基：花生米粉、葡萄糖、尿素、硝酸銨、硫代硫酸鈉金屬釷、乙酰胺、CaCO3、玉米油、硅油150-200r/min； 前60小時(shí)3360 ph6.4-6. 6，26。 60小時(shí)后：ph6.7、24。 6.3發(fā)酵培養(yǎng)和工藝控制特羅爾操作方式：反復(fù)分批發(fā)酵槽： 100m3，投入80m3.6-10次，投入量

15、10，間隔24h。 發(fā)酵周期： 180-220h，發(fā)酵過(guò)程需要連續(xù)流過(guò)葡萄糖、硫酸銨和前體物質(zhì)的苯乙酸鹽，而且補(bǔ)糖率是最重要的控制指標(biāo)，可以在不同時(shí)期逐步控制。 工藝控制特羅爾批處理操作特羅爾基質(zhì)濃度前40小時(shí)：培養(yǎng)基中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)給葡萄糖、氮?dú)庠春捅揭宜岬龋S持一定的最佳濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長(zhǎng)合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加，降低了成本。 糖與6APA結(jié)合形成糖基6APA，影響青霉素的產(chǎn)量。 a .流加碳源根據(jù)殘?zhí)?、pH、排瓦斯氣體中的CO2和O2含量進(jìn)行控制。 殘?zhí)菫?.3-0.6左右，pH開(kāi)始上升后放入砂糖。 葡萄糖的波動(dòng)范圍很窄，濃度過(guò)低的

16、話抗生素合成速度會(huì)變慢或停止，過(guò)高的話呼吸活性會(huì)降低，引起自我溶解。 (1)培養(yǎng)基、b .流加氮源控制玉米淀粉：最優(yōu)選含有多種氨基酸和作為其前驅(qū)物的苯乙酸和誘導(dǎo)體。 補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源：硫酸銨、試劑氨水、尿素氨基氮濃度： 0.01-0.05%。 c .鹽絡(luò)離子控制無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀元素等。 鐵元素對(duì)青霉素合成有毒，在30-40 ug/ml以下。 在罐壁上涂上環(huán)氧樹(shù)酯保護(hù)層。d .青霉素側(cè)鏈前驅(qū)物添加時(shí)期：合成階段種類：苯乙酸及其誘導(dǎo)體、乙酰胺、苯胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制細(xì)胞球生長(zhǎng)和青霉素合成。 對(duì)策：低濃度流加濃度：苯乙酸0.1%、乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供給速度比生物合成需求稍大。 (2) .分泌細(xì)胞溫度控制適當(dāng)菌絲生長(zhǎng)溫度30、青霉素25。 20青霉素破壞少，周期長(zhǎng)。 溫度因變溫控制、階段而異。 生長(zhǎng)階段：是較高的溫度，適當(dāng)降低溫度以使生長(zhǎng)時(shí)間縮短的生產(chǎn)期有助于青霉素合成。 前期控制特羅爾26左右，后期降溫控制特羅爾24，(3). pH控制特羅爾合成在適當(dāng)?shù)膒H6.46.6左右，不要添加超過(guò)7.0的直接酸和堿：自動(dòng)控制流加葡萄糖：定速變速取決于pH變化的速度。 pH值下降：補(bǔ)充CaCO3、通阿摩尼亞、尿素或提高通氣量pH值上升：糖、大姨媽酸性物質(zhì)(硫酸銨、油脂)、(4)溶解氧控制30飽和度，收率急劇下降10，引起不可逆的損害