1、Membrane Biophysics,尹長城 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系,2. 膜蛋白的拓撲學(xué),為什么要了解膜蛋白的拓撲學(xué)？,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能 膜蛋白的功能具有跨膜方向性 了解膜蛋白的功能必須了解其膜拓撲學(xué),什么是膜蛋白拓撲學(xué)？ (membrane protein topology),1. 蛋白質(zhì)序列中的跨膜片斷 那些部位插膜 2. 蛋白質(zhì)在膜上的取向 那些部分位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，那些部分位于細胞膜的外側(cè),2.1 膜蛋白拓撲取向的基本原理,2.1.1 疏水性原則 脂雙層的碳氫鏈區(qū)是高度疏水的區(qū)域 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域必定是高度疏水區(qū)域 蛋白質(zhì)一般以-螺旋形式跨膜 跨膜-螺旋的長度一般為20個氨

2、基酸 以20個氨基酸為單位，計算蛋白質(zhì)序列的疏水性 蛋白質(zhì)中疏水性大的序列，即為可能的跨膜區(qū)域,2.1 膜蛋白拓撲取向的基本原理,2.1.2 正電荷氨基酸向內(nèi)原則 對大量已知結(jié)構(gòu)的膜蛋白統(tǒng)計分析表明，荷正電的氨基酸傾向于位于胞質(zhì)一側(cè) 線粒體、葉綠體中荷正電的氨基酸則位于基質(zhì)一側(cè) 此規(guī)則只適用于長度小于60個氨基酸的片斷 隨片斷長度的增加，正電荷氨基酸位于內(nèi)側(cè)的幾率降低,正電荷氨基酸在質(zhì)膜內(nèi)外的分布,肽段中正電荷所占比例 與loop長度的關(guān)系,質(zhì)膜內(nèi),質(zhì)膜外,含電荷氨基酸肽段 長度幾率分布,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.1 蛋白質(zhì)疏水性分析 1. 以10-20個連續(xù)的氨基酸為計算單位，

3、計算該肽段疏水指標(biāo)之和（eg. 1-10, 2-11, 3-12, etc.）作為該肽段的疏水指數(shù)（hydropathy index） 2. 以疏水指數(shù)對氨基酸序號作圖 3. 具有高的疏水指數(shù)的一個20個氨基酸的肽段即為可能的跨膜螺旋片斷,疏水性的定量計算,Go越正（0)，表示氨基酸越難從有機相轉(zhuǎn)移至水相，即越疏水 Go越負(0)，表示氨基酸越易從有機相轉(zhuǎn)移至水相，即越親水 Go用來代表氨基酸的疏水性,氨基酸的疏水性,疏水性氨基酸：Phe, Met, Ile, Leu, Val 親水性氨基酸：Arg, Asp, Lys, Glu, Asn, Gln, His,細菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu),預(yù)測,實測,2

4、.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.2 酶解法 蛋白質(zhì)包埋在脂雙層中可抵抗水解酶的作用 利用水解法可判斷蛋白質(zhì)暴露于膜外的部分 選擇水解酶的作用方式可判斷蛋白的取向 外側(cè)加水解酶：蛋白向外部分發(fā)生水解 內(nèi)側(cè)加水解酶：蛋白向內(nèi)部分發(fā)生水解,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.2 酶解法 制備蛋白取向一致的膜囊泡 加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶） 加入酶抑制劑終止反應(yīng) SDS-PAGE 分析,酶解法,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.2 酶解法 蛋白酶抑制劑必須有效 保證有限酶解，不是完全酶解 應(yīng)用多種水解酶，互相印證結(jié)果 陰性結(jié)果說明 蛋白質(zhì)沒有膜外部分 或 膜外部分無水解酶切位點 檢測

5、方法： 如所研究蛋白占大部分，可直接分析 如所研究蛋白占少部分，須應(yīng)用抗體或其它標(biāo)記方法分析,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.3 同位素標(biāo)記法 制備蛋白取向一致的膜囊泡 125I標(biāo)記 SDS-PAGE 放射自顯影分析 選擇標(biāo)記方式可判斷蛋白的取向 外側(cè)標(biāo)記：蛋白向外部分被標(biāo)記 內(nèi)側(cè)標(biāo)記：蛋白向內(nèi)部分被標(biāo)記,同位素標(biāo)記法,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.3 免疫學(xué)方法 制備蛋白取向一致的膜囊泡 加入膠體金標(biāo)記的針對特定肽段的單克隆抗體 電子顯微鏡觀察 分析,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.4 化學(xué)標(biāo)識法 極性試劑 不能插膜：標(biāo)記蛋白質(zhì)膜外部分 非極性試劑 可以插膜：標(biāo)記蛋

6、白質(zhì)膜內(nèi)部分 將化學(xué)標(biāo)識物事先用放射性同位素標(biāo)記，反應(yīng)后用放射自顯影檢測,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.4 化學(xué)標(biāo)識法 制備蛋白取向一致的膜囊泡 加入同位素標(biāo)記的識別特定位點的化學(xué)標(biāo)識試劑 SDS-PAGE 放射自顯影,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.5 特殊部位定位法 糖基化位點：位于細胞膜的外側(cè) 磷酸化位點：位于細胞質(zhì)一側(cè) 通過分析蛋白質(zhì)上的這些位點即可推知相應(yīng)修飾位點的拓撲取向,2.2 膜蛋白拓撲學(xué)的研究方法,2.2.6 融合蛋白法 原理： 特定蛋白質(zhì)在特定的細胞器內(nèi)方有活性 將待定蛋白基因與報告蛋白基因融合 將融合基因在適當(dāng)宿主細胞中表達 測定報告蛋白的定位 優(yōu)點：原

7、位細胞器定位 缺點： 融合蛋白可能破壞原蛋白的拓撲取向 融合蛋白可能破壞原蛋白的構(gòu)象及生化活性,2.3 影響膜蛋白拓撲取向的因素,1. 信號肽 蛋白質(zhì)剛合成時N端帶一條短肽-信號肽， 長度為15-25氨基酸，帶正電荷 信號肽的功能 阻止新生肽鏈過早折疊，以利于轉(zhuǎn)運 與膜上特異受體結(jié)合，實現(xiàn)選擇性跨膜轉(zhuǎn)運 正電荷使得信號肽不能跨膜轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致蛋白選擇信號肽朝內(nèi)的拓撲取向 （圖）,2.3 影響膜蛋白拓撲取向的因素,2. 跨膜電位 Anderson等構(gòu)建了Lep蛋白的突變體，在其N端引入不同數(shù)量的正電荷 在跨膜電位存在時，蛋白質(zhì)的N端朝內(nèi) 當(dāng)膜電位消失時，蛋白質(zhì)的N端朝外 正電朝內(nèi)依賴于膜電位（圖） 細胞的電位內(nèi)負外正，正電向內(nèi)能量上有利,2.3 影響膜蛋白拓撲取向的因素,3. 膜上負電荷磷脂的比例 Kruijff等構(gòu)建了E.