1、第六講基因克隆的質粒載體吳乃虎遺傳和發(fā)育生物學研究所2005年8月基因克隆的質粒載體一.導言1.質粒是一種顯著的亞細胞生物它的結構比病毒簡單。它既沒有蛋白質外殼，也沒有細胞外生命周期。它只能在宿主細胞中增殖，并隨著宿主細胞的分裂而遺傳。2.質粒有多種類型F-質粒：F-因子或性別質粒，它能把宿主染色體上的基因和F-因子一起轉移到宿主受體細胞中，而在此之前質粒是不存在的。R質粒：被稱為抗性因子，R因子)，它編碼一個或幾個抗生素抗性基因，并且可以將這種抗性轉移到缺少該質粒的合適的受體細胞。Col質粒：所謂的Col質粒，是一種產(chǎn)生大腸桿菌素的因子，編碼一種控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌可以殺死沒有

2、Col質粒的密切相關的細菌菌株。3.質粒載體20世紀70年代實驗室構建的最廣泛使用的基因克隆載體之一。二、質粒的一般特征1.質粒脫氧核糖核酸(細菌質粒的定義)*1 .大腸桿菌的質粒是一種共價閉合的環(huán)狀DNA (cccdna)，它獨立于宿主染色體進行復制。除了酵母的黑仔質粒是核糖核酸質粒外，其他質粒都是質粒。然而，質粒DNA的復制必須依賴于宿主提供的核酸酶和蛋白質。*2 .質粒的分子大小文獻中有三種說法：小的只有103KD，只能編碼2-3個蛋白質；大的可以達到105千道爾頓，兩者相差幾百倍。1Kb200Kb (Sambrok等人)5Kb400Kb(萊寧格爾)MD(兆道爾頓)=106D(兆道爾頓)

3、1.5Kb1MD*3 .質粒DNA與宿主染色體DNA的關系一般來說，質粒DNA可以在宿主染色體外保持自由狀態(tài)，但在某些條件下，它可以可逆地整合到宿主染色體中，然后復制和細胞分裂成后代。*4 .質粒DNA的分子構型超螺旋構型：也就是說，由共價閉合的環(huán)狀cccDNA呈現(xiàn)的超螺旋構型。走在凝膠前面。環(huán)狀構型：即開環(huán)的脫氧核糖核酸構型，其中一條脫氧核糖核酸鏈保持完整的環(huán)狀結構，而另一條鏈有一到幾個間隙。走進凝膠的最后一格。l構型：由雙鏈斷裂形成的線性DNA分子的構型，稱為l型。走在凝膠中間。2.質?？寺≥d體的必要條件(三個常見成分)(1)具有復制區(qū)域或復制因子(復制器)復制因子：它是指一種特定的質粒D

4、NA，它包含質粒DNA的ori(復制起點)，以及編碼質粒DNA和質粒復制所需的DNA序列結構。*注意復制器和復制器之間的概念差異。復制子：指含有復制起始位點的DNA復制單位，如細菌染色體、病毒基因組、質?；蚪M等。任何基因單位，只要它的脫氧核糖核酸能自動復制，就叫做復制子。*一般來說，質粒只包含一個復制起點，并構成一個獨立的復制子。然而，在少數(shù)情況下，融合產(chǎn)生的質粒也含有兩個復制子，但只有一個是活性的?？股乜剐曰蚶硐氲馁|粒克隆載體應具有兩種抗生素抗性基因，以便為宿主細胞提供易于檢測的表型性狀作為選擇標記，并且通過將外源DNA片段插入相關的限制性酶識別位點而形成的重組質粒應至少保留一個強選擇

5、標記。具有幾個限制性酶的單一識別位點這種分子結構特征可以滿足基因克隆的需要，插入適當大小的外源基因片段后，質粒的復制功能不會受到影響。分子量較小，拷貝數(shù)較高這種質粒的優(yōu)點是：A.低分子量質粒易于操作，在克隆外源基因片段(一般不超過15Kb)后仍能有效地轉化為受體細胞；B.較高的拷貝數(shù)有利于質粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量；C.低分子量質粒分子中特定限制性酶的多個識別位點的概率將相應降低；3.質粒編碼的表型質粒的分子量小，僅占細胞染色體的一小部分，一般約為3%。盡管質粒的分子量很小，但它編碼重要的遺傳性狀：A.抗性特征：抗生素抗性、重金屬抗性、毒性陰離子抗性和其他抗性。B.代謝

6、特征：抗生素和細菌素的合成；簡單碳水化合物(如乳糖和蔗糖)的代謝；復合碳水化合物(甲苯、苯胺)和鹵代化合物的代謝；蛋白質代謝；固體氮作用；H2S合成；檸檬酸的利用；歐文氏菌色素形成：產(chǎn)堿桿菌的反硝化活性。產(chǎn)堿桿菌合成硫胺素。和歐文氏菌。C.改變宿主生活方式的因素：大腸桿菌腸毒素的合成：金黃色葡萄球菌剝脫毒素的合成：炭疽桿菌外毒素的合成：蘇云金桿菌l-內毒素的合成：破傷風桿菌神經(jīng)毒素的合成：大腸桿菌定殖抗原的合成：大腸桿菌和鏈球菌溶血素的合成；腸道細菌的血清耐藥性；耶爾森氏菌的毒性：炭疽桿菌莢膜的合成：鐵在大腸桿菌中的轉運。D.其他特征：芽孢桿菌細胞中氣泡的形成；鏈霉菌的布萊恩形成(致死結)；肺

7、炎克雷伯菌Kik IncN質粒的致死效應；土壤桿菌對細菌素的敏感性；麻風桿菌半透明/不透明菌落的變異：Nod Flx豌豆根瘤菌的根際蛋白質合成；盲腸acter包涵體的生成；葡萄球菌的內肽酶活性。4.質粒的轉移(1)接合質粒和非接合質粒*接合質粒：也稱為自我轉移質粒，帶有自我復制基因?？刂萍毦鋵唾|粒接合轉移的基因；*非接合質粒：也稱為不能自我轉移的質粒，它有一個自我復制的基因，但失去了控制細胞配對和接合轉移的基因，因此它不能從一個細胞轉移到另一個細胞。大腸桿菌素基因大腸桿菌Col質粒非共軛質粒具有抗生素抗性基因的大腸桿菌r質粒也稱為r因子。帶有宿主染色體DNAF因子結合質粒(因子)加大腸桿菌

8、素基因大腸桿菌素Col質粒添加抗生素抗性基因大腸桿菌重組質粒和重組因子結合質粒因子是最具代表性的結合質粒：f因子在宿主菌中的三種存在方式：A.染色體外雙鏈環(huán)狀DNA，f細胞B.染色體外雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸細胞宿主染色體片段C.以線性DNA的形式整合到Hfr細胞中在宿主染色體上。接合質粒f因子的接合轉移；F細胞和F細胞，以及有性須的毛狀結構F細胞和F細胞共培養(yǎng)，這些細胞由性須配對。這個過程叫做細菌結合在細胞配對過程中，F(xiàn)細胞中的F因子遵循滾環(huán)復制模式，通過性須通道進入F細胞(單鏈)細胞變成細胞質粒的接合和轉移以及基因工程的安全載體；從基因工程的安全性角度來看，我們主要對非共軛質粒感興趣：原因如下

9、：(1)聯(lián)合型不僅轉移自身；也可引起宿主染色體片段的轉移；如果F因子整合到宿主染色體中，會影響染色體的高頻轉移。(4)引起其他非共軛質粒的遷移。5.質粒DNA的動員(1)質粒DNA遷移的概念由共存的接合質粒引發(fā)的非接合質粒的轉移過程稱為質粒DNA的遷移。非接合質粒不能自我轉移，因為它的分子量小到足以編碼轉移過程中所需的所有基因。然而，如果在宿主細胞中存在共存的接合質粒，它們通?？梢员晦D移。質粒DNA遷移的原理ColE1質粒是一種遷移性非接合質粒ColE1質粒遷移的生化過程：遷移條件Bom位點，(位于ColE1質粒分子上)由mob基因編碼的核酸酶也被稱為遷移蛋白*1.bom位點也稱為nic位點，

10、遷移蛋白作用于nic位點，從而誘導非連接質粒遷移。Mob基因=聯(lián)合動員基因。Nic位點=當啟動接合DNA轉移時，自轉移接合質粒在轉移起點oriT受到鏈特異性和位點特異性單鏈切割的DNA位點。*2 .許多質粒載體在構建過程中丟失了nic位點，因此無法遷移。nic-質粒的轉移途徑是形成融合質粒，使它們成為形式上的接合質粒的一部分。*3 .重組缺陷宿主菌株的應用在有重組缺陷的宿主菌株中，nic質粒不會與接合質粒重組，因此nic質粒在recA宿主中比nic質粒更穩(wěn)定。*4 .圖4-5說明6.質粒DNA的復制類型低拷貝數(shù)質粒受“嚴格質?！笨刂聘呖截悢?shù)質粒的“松弛質?！辟|?？截悢?shù)的定義：文獻中常用兩種定義

11、A.通用定義：當在標準培養(yǎng)基中生長時，每個細菌細胞中包含的質粒DNA分子的數(shù)量。B.特殊校準：在富培養(yǎng)基中快速生長的細菌細胞可以有3-4個染色體，而在碳供應不足的培養(yǎng)基中緩慢生長的細菌細胞平均只有1.1個染色體。因此，在一些文獻中質?？截悢?shù)的定義是每個細菌細胞中每條染色體上質粒DNA分子的平均數(shù)。C.這本書定義了在LB液體培養(yǎng)基中生長的每個細胞含有20個以上的質粒，這被稱為高拷貝數(shù)質粒；當拷貝數(shù)小于20時，稱為低拷貝數(shù)質粒。7.質粒的不相容性不相容，即不相容定義：指在沒有選擇壓力的情況下，兩個密切相關的質粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。注意：只有當有明確的證據(jù)表明第二個B已經(jīng)進入含有質粒

12、A的宿主細胞，并且其DNA沒有被宿主細胞限制系統(tǒng)降解，但這兩個細胞不能長時間共存時，只有在這種情況下我們才能說A和B是不相容的質粒。不相容組的概念：彼此不相容的質粒屬于同一不相容組?？梢韵嗷ス泊娴馁|粒屬于不同的不相容組。同一個不相容群體的南方粒在遺傳關系上是密切的。質粒不相容的分子基礎質粒不相容的分子基礎主要是由它們的復制功能之間的相互干擾引起的：*1負反饋環(huán)大多數(shù)質粒產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏蛋白可以控制質粒的復制，阻遏蛋白的數(shù)量與細胞中質粒的拷貝數(shù)成正比。當質粒的拷貝數(shù)較少時，細胞中的阻遏蛋白相對減少，因此阻遏蛋白與質粒DNA中的靶序列相互作用使其復制。隨著質粒DNA的復制，質粒的拷貝數(shù)增加，因此

13、編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白數(shù)量增加。由于細胞中阻遏蛋白的濃度增加，將形成二聚體，從而失去與質粒結合并促進其復制的能力。結果質粒復制停止，即質?？截悢?shù)受被抑制蛋白的負反饋調節(jié)：負反饋控制回路(負反饋回路)當質粒面對高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時，其復制活性被抑制。當質粒的拷貝數(shù)低，阻遏蛋白濃度低時，其復制活性將繼續(xù)。*2 .同一細胞含有兩個相容的質粒因為這兩個相容的質粒是遠相關的，它們產(chǎn)生的阻遏蛋白不會影響另一個質粒的復制。因此，這兩種相容的質粒在同一細胞中保持正常的拷貝數(shù)。*3 .同一細胞含有兩個不相容的質粒鑒于這些不相容質粒之間的密切遺傳關系，由它們產(chǎn)生的阻遏蛋白不僅影響它們自身質粒DNA的復制，還影

14、響彼此質粒DNA的復制。因此，兩種阻遏蛋白共同調節(jié)質粒的復制速率。質?？截悢?shù)控制系統(tǒng)不能區(qū)分這兩種不相容的質粒，只能隨機選擇其中一種進行復制。因此，會出現(xiàn)拷貝數(shù)偏差。兩個不相容的質粒通常有不同的拷貝數(shù)，高拷貝數(shù)對復制抑制劑的敏感性低于低拷貝數(shù)。因此，當復制抑制劑(阻遏蛋白)的濃度較低時，高拷貝質粒仍然可以復制，從而可以消除(稀釋)低拷貝質粒。3.質粒的分離和純化1.氯化銫-EtBr密度梯度離心原理(1)宿主染色體DNA和質粒DNA的高級結構差異*質粒DNA分離純化的分子本質是如何區(qū)分細胞破裂后釋放的染色體DNA和質粒DNA混合物中的質粒DNA和染色體DNA，從而只獲得質粒DNA。*然而，質粒D

15、NA和染色體DNA在化學結構上沒有區(qū)別。因此，為了將質粒DNA與其宿主染色體DNA區(qū)分開來，達到分離純化的目的，必須從其DNA的高級結構中尋找突破口。實驗表明，在細胞裂解和DNA分離過程中，高分子量的細胞染色體DNA容易斷裂成相應的線性片段，而質粒DNA由于其分子量小、結構緊湊而保持完整。氯化銫-EtBr密度梯度離心是一種經(jīng)典的分離和純化質粒DNA的技術，它是基于宿主染色體DNA和質粒DNA在高級結構上的差異(或異質性)。(2)CsCl的作用在氯化銫密度梯度離心中，氯化銫用作介質，其密度為1.7g/cm3。超速離心平衡一段時間后，形成1-1.9052克/立方厘米的連續(xù)浮力密度梯度。眾所周知，大腸桿菌宿主染色體DNA、質粒DNA、大腸桿菌宿主染色體DNA和核糖核酸四種大分子物質具有不同的浮力密度，因此它們在超速離心平衡后會以等密度位置分布在CsCl連續(xù)密度梯度介質中，從而達到相互分離的目的：A.浮力密度=2.0g/cm3的核糖核酸大分子沉入離心管