1、苯硫脲的群體遺傳學(xué)考察、1 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1)測定群體中PTC味基因的顯性性狀和基因型，了解孟德爾基因型與顯性性狀的對應(yīng)關(guān)系。 (2)了解酶催化劑截?cái)喾糯笃鞫鄳B(tài)性序列(caps ) (也稱為PCR RFLP )技術(shù)的原理，并使用caps技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs )。 在分子水平上測定PTC味的基因型。 (3)修正集團(tuán)中PTC味道的基因頻率，判斷集團(tuán)是否達(dá)到了Hardy-weiberg平衡。 2、實(shí)驗(yàn)原理：苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC )是硫脲的苯誘導(dǎo)體(圖2.1 )，均為白色結(jié)晶粉末，均含硫代酰胺化學(xué)基(N-C=S )官能化學(xué)基均有苦味。 能夠品嘗到1/750

2、，0001/50，000 PTC濃度的溶液的味道的人(苦澀，少數(shù)人感到甜味)被稱為苯硫脲，“品嘗到味道的人只能品嘗到PTC濃度為1/24，000以上的溶液的味道(對于PTC的結(jié)晶物PTC味覺能力是由單基因調(diào)控的孟德爾遺傳性狀，由7號染色體上(7q35-7q36 )的苦味味覺感受器基因TAS2R38確定，其屬于常染色體不完全顯性遺傳。 品味者中的顯性基因t的純合子(TT )可以品嘗1750，00016，000，000的PTC溶液的苦味，異質(zhì)結(jié)子(TT )只能品嘗1480，000 l380，000的PTC溶液的苦味。 因此，利用對PTC的品味能力可以測定家族中的基因傳遞和人中的基因頻率。 2.2人

3、硫脲味的基因人的PTC味的基因Homo sapiens taste receptor、type 2、member38(TAS2R38)(NM_176817 )、PTC， 也稱為T2R38或ttc的大部分味覺者與味覺者的差異為三處單核苷酸多態(tài)性(SNPs ) :一處為第145位，味覺者為G145 (查詢密碼丙氨酸ala )，味覺者為C145 (脯氨酸) 第三位是第886位，味覺者為A886 (查詢密碼異亮氨酸ile )，味道者為G886 (查詢密碼纈氨酸val )。 因此，與味覺者的PTC多肽中的3個(gè)部位對應(yīng)的氨基酸分別為ala49、val262和ile262，被稱為AVI等位基因，味覺者的3個(gè)

4、部位為pro49、ala262和val262，被稱為PAV等位基因(圖2.2、2.0 ) 在味覺者的PTC查詢密碼區(qū)域中存在5個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶Fnu4H1的識別部位(識別序列5-GCNGC-3 )，作為味覺者，第785位的SNP正好形成了多馀的Fnu4H1識別部位(GC )。 因此，利用這種基于SNP的限制性位點(diǎn)多態(tài)性，可通過引物擴(kuò)增包含785位SNP位點(diǎn)的PTC基因查詢密碼區(qū)的一部分，用Fnu4H1截?cái)鄶U(kuò)增產(chǎn)物，并切開擴(kuò)增產(chǎn)物，從而判定某人為單倍型(haplotype ) 3 .實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線，4 .實(shí)驗(yàn)步驟4.1說明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線的實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)主要儀器設(shè)備的使用方法

5、、注意事項(xiàng)(1周前說明，給學(xué)生準(zhǔn)備時(shí)間) (1)說明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線。 (2)說明口腔上皮細(xì)胞球總DNA的快速提取、基因PCR擴(kuò)增、DNA陽離子電泳、PCR產(chǎn)物純化、DNA酶催化劑切割、遺傳學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)方法和注意事項(xiàng)。 (3)高壓蒸汽滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、陽離子電泳修訂、水平陽離子電泳槽、渦卷震蕩器、磁力攪拌器、電子天平、PCR修訂、微波爐、紫外分光光度修訂、電磁爐、恒溫水族箱、恒溫干熱會議、凝膠成像裝置，制作，4.2 PTC味覺能力的測定4.2.1實(shí)驗(yàn)材料4.2.1主要儀器設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋清潔，121高壓滅菌20min容量瓶，量筒，燒杯，螺絲口試劑瓶，一次性物

6、品醫(yī)療用無菌PE手套，乳膠手套，塑料杯，馬克筆。 4.2.1.2試劑和材料(1)材料：受試者是為全體人員完成遺傳學(xué)大實(shí)驗(yàn)的學(xué)生。 (2)試劑：苯并硫脲(PTC )結(jié)晶、寶貝兒哈哈純水.4.2.1.3溶液調(diào)制(1)原液(1號液) :稱量PTC結(jié)晶0.65 g，加入寶貝兒哈哈純水500 ml，室溫下將(2)稀釋液：原液214倍用寶貝兒哈哈純水階段性稀釋，制成2-14號(2) 。 對調(diào)制的14種濃度的PTC溶液進(jìn)行過濾滅菌，分別放入滅菌后的100 ml螺絲口試劑瓶中，另外將寶貝兒哈純水作為第15號液。 4.2.2實(shí)驗(yàn)方法(1)使受試者正坐，張開嘴伸舌，用滴管將15號液滴到受試者的舌根部，讓受試者慢慢

7、吸口嘗味，用純水進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，交替讓受試者嘗味，避免了受試者的猜測(參照專利文獻(xiàn)1 ) (3)如果無法鑒別或無法鑒別，則依次用141號溶液反復(fù)試驗(yàn)，直到能夠明確鑒別出PTC的苦味。 (4)嘗三次，只有三次的結(jié)果相同，才是正確的。 (5)記錄出品苦味的液體編號和稀釋濃度。 4.3人口腔上皮細(xì)胞球總DNA的提取4.3.1實(shí)驗(yàn)材料4.3.1.1主要器械設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、潔凈臺、恒溫水族箱、渦卷震蕩器、高速離心機(jī)、恒溫振蕩床、微量移液器、電爐清潔、121高壓滅菌20min量筒、燒杯， 螺絲口試劑瓶、牙簽、1.5 mL滅菌微離心管、微量移液器吸引頭(槍頭)、離心管架、一次性物品

8、醫(yī)療用無菌PE手套、口罩、馬克筆。 4.3.1.2試劑和材料(1)材料：每組實(shí)驗(yàn)選擇1名受試者，用滅菌牙刮除口腔上皮細(xì)胞球。 (2)試劑：滅菌水、pH參比溶液、細(xì)胞球染色體組DNA提取試劑盒4.3.2的實(shí)驗(yàn)方法(1)滅菌微量離心管1.5 ml中裝入滅菌水100 L。 (2)受試者用無菌牙簽輕輕地刮口腔頰的內(nèi)側(cè)，刮下的細(xì)胞球在滅菌水中立即。 (3)渦卷震蕩器渦卷振動混練10 s，(4)離心機(jī)瞬時(shí)離心10 s。 (5)在沸水浴中煮沸5分鐘。 (6)離心機(jī)13200rpm離心2分鐘。 (7)基因組DNA 4C保存準(zhǔn)備，4.4 PCR擴(kuò)增PTC基因片段4.4.1實(shí)驗(yàn)材料4.4.1.1主要儀器設(shè)備高壓蒸

9、汽滅菌鍋，高速離心機(jī)，小型瞬時(shí)離心機(jī)，渦震蕩器，PCR修訂，pH修訂，制冰機(jī)清潔，121高壓滅菌20min的1.5 mL微量離心管，PCR管，微量移液器抽吸4.4.1.2試劑和材料(1)材料：各組受試者口腔上皮細(xì)胞球染色體組DNA (2)試劑： Taq DNA多聚酶、dNTPs、滅菌高純水、Tris鹽化學(xué)基、Na2EDTA.2H2O PCR引物可委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，期望擴(kuò)增產(chǎn)物303 bp 上游引物： hptcforward5- aactggcagaataagatagatctcaattat-3下游引物： hptcreverse5- aacaaccatcaccctattt-34.4

10、.1 (2) PCR引物工作液： PCR引物(3)TE緩沖液： 10 mmol/ltrishclph8. 0、1 mmol/ledtaph8. 0， 4.4.2的實(shí)驗(yàn)方法(1)從制冰機(jī)中取出碎冰(0C )，根據(jù)從冰箱中取出的(4)碎冰配方和順序在PCR管中制備PCR緩沖液(為了保持酶活力，保持PCR擴(kuò)增的專一性和效率，始終在低溫下制備)滅菌高純水31.5 l 10 PCR buffer (為了保持PCR擴(kuò)增的效率) 5.0l 25 mmm gcl 2.0 l 10 mmdntps 1.0 l 10 mhptcforwardprimer 1.0 l 10 mhptcforwardprimer 1

11、.0 ltaq多聚酶1.0L (建議向多個(gè)學(xué)生混合以上混合液，然后分注43.5 ul ) 受試者口腔上皮細(xì)胞球染色體組DNA 6.5L的總體積50L (5)加蓋后，用手指輕輕彈管壁，混入液體，以13200rpm離心10 s (將液體扔到離心管底部)。 (6)在管子上做上標(biāo)記放入PCR器中(等待其他學(xué)生一起開車)。 (94C 94C 55C 72C 72C 4C預(yù)改性5 min改性30s退火30s延長30s延長10 min無限40周期(8)PCR產(chǎn)物4C保存應(yīng)用備份、4.5 PTC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的陽離子電泳檢測4.5.1實(shí)驗(yàn)材料4.5.1.1主要儀器設(shè)備高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、陽離子電泳

12、、 水平陽離子電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠圖像拍攝器、制冰機(jī)、潔凈臺、通風(fēng)架清潔、121高壓滅菌20min的微量移液器吸引頭(槍頭)、離心管信息幀、PCR管信息幀、三角瓶、一次性物品醫(yī)療用無菌PE手套、馬克筆、保鮮袋、微波爐用手套、三角瓶、搪瓷盤。 4.5.1.2試劑和材料(1)材料：受試者PTC基因PCR產(chǎn)物(2)試劑： Tris鹽化學(xué)基、冰冰乙酸、Na2EDTA.2H2O、溴化乙錠、阿加德里肌肉、markee 57.1ml冰冰乙酸、37.2g Na2EDTA.2H2O、脫絡(luò)離子水：取50TAE陽離子電泳緩沖液，脫絡(luò)離子水稀釋50倍(3)0.5mg/ml溴化乙錠(4)溴化乙錠(EB )工作

13、液： 0.5mg/ml EB(1000存積液)，脫絡(luò)離子水稀釋1000倍。 (注： EB為扁平分子，可植入DNA，是一種潛在的誘變劑，接觸時(shí)攜帶一次性物品醫(yī)用無菌PE手套，但并非洪水猛獸，不慎接觸皮膚時(shí)，皮膚吸收的只是表面，用大量流水沖洗即可。 4.5.2實(shí)驗(yàn)方法(1)制備阿加里肌肉凝膠1.2% :稱量阿加里肌肉凝膠0.6g，裝入三角瓶中，加入50ml 1TAE的陽離子電泳緩沖液，用微波爐加熱，不斷取出混合，直到燒瓶中的阿加里肌肉凝膠粉完全溶解，將留心50ml倒入剛剛大的橡膠中(2)在桌子上放上糨糊液，在室溫下蒸發(fā)制冷加熱，但不燒手(約50-60C )。 (3)將梳子插入凝膠成型模具的正確位置

14、后，慢慢倒入凝膠溶液。 橡膠溶液注入到與模具的低邊緣平坦為止即可。 在桌子上靜置10-20分鐘，等待糨糊完全凝固。 小心拔出梳子(剩下的凝膠溶液封口后溶化使用)，使凝膠不進(jìn)入陽離子電泳槽的陽離子電泳液，使凝膠的有樣品孔的一側(cè)朝向陽離子電泳槽的負(fù)極。 (4)取1片有光紙，加入滅菌水5L、樣品緩沖液2L 6，再加入PCR產(chǎn)物5L，制成10L DNA樣品。 (5)選擇與凝膠相鄰的取樣孔。 用10l的吸液頭分別依次加入5L Marker I進(jìn)行對照，各組12L PCR產(chǎn)物的陽離子電泳樣品(相互比較) (6)根據(jù)陽離子電泳槽的長度調(diào)整了陽離子電泳校正的電壓為120V(10V/cm )、陽離子電泳為203

15、0min。 (請注意正負(fù)電極的位置正確連接。) (7)在裝有EB的搪瓷器皿中慎重地放入凝膠，染色10分鐘后，用自來水浸泡10分鐘。 (8)放入凝膠影像學(xué)系統(tǒng)中拍攝攝影圖片。、4.6 PTC基因PCR產(chǎn)物酶催化劑剪接4.6.1實(shí)驗(yàn)材料4.6.1.1主要儀器設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、高速離心機(jī)、小型瞬時(shí)離心機(jī)、渦旋震蕩器、磁力攪拌器、恒溫水族箱、恒溫干熱會議、制冰機(jī)、紫外分光光度校正、微量清潔，121高壓滅菌20min的1.5 mL滅菌微量離心管， 吸微量移液器頭(槍頭)、離心管信息幀、一次性物品醫(yī)療用無菌PE手套、塑料飯盒、馬克筆。 4.6.1.2試劑和材料(1)材料：受試者PTC基因PCR產(chǎn)物(2)試劑：限制性酶催化劑Fnu4H1 4.6.2實(shí)驗(yàn)方法(1)2小時(shí)前將恒溫水族箱或恒溫干熱校正(或恒溫水族箱)從(2)制冰機(jī)中取出碎冰(0C )，冰箱中取出必要的試劑(5)采集受試者的PTC基因1L，純化DNA，用紫外分光光度校正測定其260nm、280nm下的紫外吸光光度值，進(jìn)行DNA量化分析。 (6)在碎冰上按照處方和步驟在1.5 mL的微離心管中制備酶催化