1、實時熒光定量PCR技術原理、應用及實踐,(Real time Quantitative PCR),Real time Quantitative PCR,主要內(nèi)容,Real-time qPCR的定量原理,2,Real-time qPCR的檢測方法,3,Real-time qPCR的基本概念,1,Real-time qPCR的解析方法,4,PCR：基本原理,Denaturation: 94 96C,Annealing: 50 65C,Extension: 70 75C,基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T,PCR：基本原理

2、,理想的PCR反應： N=N0*2n 實際的PCR反應： N=N0* (1+E)n N0：初始模板量 N：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 n：擴增反應的循環(huán)次數(shù) E：擴增效率,S形曲線，具有平臺效應,與普通PCR的對比,同一個樣本進行96次重復,傳統(tǒng)PCR檢測,Real time PCR 檢測,Real time PCR-起點檢測： - 起點量是樣本中起始的DNA量 - “加入了500個拷貝” - 具有重現(xiàn)性，誤差小,傳統(tǒng)PCR-終點檢測： - 終點產(chǎn)物量經(jīng)過PCR放大的DNA量 - “生成了500，0000，0000個拷貝” - 不恒定，誤差大,傳統(tǒng)PCR檢測,Real-time qPCR,激發(fā)光,發(fā)

3、射光,- 在PCR反應體系中加入熒光基團。 - 熒光基團在激發(fā)光的作用下，產(chǎn)生波長更長的發(fā)射光。 - 利用熒光信號的變化動態(tài)監(jiān)測整個反應過程。,熒光基團,擴增曲線（primary curve）,擴增曲線： 隨著PCR反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強度的變化監(jiān)測擴增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴增曲線圖。 縱坐標：Rn（熒光值） 橫坐標：cycle number（循環(huán)數(shù)）,線性圖,對數(shù)圖,熒光閾值（threshold）,基線(baseline)：一般以PCR反應前15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號 熒光閥值(threshold)：擴增曲線上

4、人為設定的一個值 - 缺省設置：PCR反應前3-15個循環(huán)熒光本底信號標準偏差的10倍 - 手動設置：大于樣本的熒光背景值,Ct 值(Cycle Threshold),Ct值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時，熒光值所對應的PCR循環(huán)次數(shù)。 起始模板量 基線 閾值 Ct值,Ct 值(Cycle Threshold),Ct值的特點： 相同模板進行96次擴增，平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，但Ct值相對固定； Ct值則極具重現(xiàn)性,Ct值可以確定初始模板量？,Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n個循環(huán)的總信號 =本底信號 + 起始DNA數(shù)目 * PCR擴增效率 * 單位信

5、號強度 當循環(huán)次數(shù)n=Ct時 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 兩邊同時取對數(shù)得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E) Ct=-klgX0+b,lgX0與Ct值呈線性關系 根據(jù)Ct值可以計算出樣本中起始模板所含有的拷貝數(shù) 起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。,Rn vs. Cycle number- 擴增曲線,LogDNA vs. Ct - 標準曲線,標準曲線 (standard curve),標準曲線分析 - 對已知或未知樣本進行系列濃度梯度稀釋,y = -ax+b 測定熒光定

6、量PCR反應的有效性 - 線性的標準曲線：相關系數(shù)R2 - 擴增效率： 擴增效率(E)=10-1/斜率-1,標準曲線分析,熒光定量PCR檢測方法,染料標記： SYBR Green I 探針標記： 水解探針： TaqMan 非水解探針：Molecular beacon,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I 是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料。 SYBR Green I只與雙鏈DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。 熒光信號與雙鏈DNA分子數(shù)成正比，隨著擴增產(chǎn)物增加而增加。,熒光信號強度與反應體系中所有雙鏈DNA分子成正比。,- 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號。 - 延伸結(jié)束時，采

7、集熒光信號。,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I,優(yōu)點： 使用方便，成本低 - 僅需設計兩個引物 通用性好 - 對DNA模板沒有選擇性,需要在反應結(jié)束時，對產(chǎn)物做融解曲線分析。,缺點： SYBR Green與所有雙鏈DNA結(jié)合 - 引物二聚體或錯誤擴增產(chǎn)物造成假陽性 - 只能檢測單一模板，無法進行多重檢測,將溫度對熒光強度的變化求導。(-dI/dT),融解曲線 (dissociation curve),確認PCR反應產(chǎn)物的特異性,對數(shù)圖譜,原始圖譜,融解曲線分析,- 非特異性產(chǎn)物 - 引物二聚體,Taqman 工作原理,探針與靶序列配對 （一段序列，兩個基團，5 報告

8、基團、3淬滅基團） 完整的探針，報告基團R發(fā)射的熒光被淬滅基團Q淬滅， 沒有熒光產(chǎn)生。 聚合酶的5外切酶活性 報告基團R與淬滅基團Q分離，發(fā)射熒光。,熒光信號強度與結(jié)合探針的DNA分子成正比。,Taqman 工作原理,在退火過程中，探針與靶序列結(jié)合,探針被Taq酶的5- 3 外切酶活性剪切成片斷,游離報告基團發(fā)出熒光,在延伸過程中，探針部分與靶序列分離,SYBR Green I與Taqman 對比,Taqman 特異性高 - 與特異靶序列結(jié)合 對模板有選擇性 - 可進行多重PCR反應,SYBR Green I 使用方便，成本低 - 僅需設計兩個引物 通用性好 - 對DNA模板沒有選擇性,熒光定

9、量PCR解析方法,絕對定量 樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克） - 檢測某給定血液樣本中的病毒顆粒數(shù)，有6000個拷貝 相對定量 不同樣本中目的基因表達量的差異 - 腫瘤組織和正常組織相比 某個基因的表達量mRNA改變了多少倍，改變了60倍,絕對定量的步驟,未知樣品Ct代入標準曲線 確定拷貝數(shù),質(zhì)粒提取 OD值測定 計算待測樣本濃度 /樣本分子量 /待測樣本拷貝數(shù),標準品進行5-6個 梯度稀釋 標準品稀釋倍數(shù)為10,絕對定量,- 樣本起始濃度與Ct呈線性關系，根據(jù)已知拷貝的標準品作出標準曲線。 -根據(jù)未知樣品的Ct值，推算出未知樣本量。,以標準品為標桿,相對定量,參照樣本 Calibrator,用

10、于比較結(jié)果的基準。,相對定量,特點,選擇內(nèi)參基因,內(nèi)參基因,beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA等 看家基因 housekeeping gene,在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小,- 文獻檢索 - 實驗篩選,內(nèi)參基因,- 同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數(shù)目不同。 - RNA抽提、反轉(zhuǎn)效率不同，操作中存在誤差。,對樣本初始濃度差異進行均一化校正。,2- Ct法,成立條件：假設擴增效率為100% 滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率接近 2）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率均為90%-110% 假設條件： 內(nèi)參基因和目標基因擴增效率差異大于5% 1

11、）優(yōu)化實驗條件，使擴增效率接近 2）使用其他方法,相對定量方法,2- Ct法,相對定量舉例,相對定量分析,待測樣品目的基因 濃度 待測樣品內(nèi)參基因 濃度 F= 對照樣品目的基因 濃度 對照樣品內(nèi)參基因 濃度,假設條件： 內(nèi)參基因和目標基因擴增效率不同 優(yōu)點：實驗優(yōu)化簡單 缺點：每一輪實驗都必需做標準曲線,雙標準曲線法,80%,相對定量舉例,雙標準曲線法,實 驗 流 程,SYBR Green法實驗流程,樣本處理,RNA提取,qPCR,數(shù)據(jù)分析,逆轉(zhuǎn)錄,樣本處理與RNA提取,外界刺激 10min 可檢測的表達改變 樣品離開定義環(huán)境 2min 裂解、固定細胞 TRIzon（酚、異硫氰酸胍） 裂解液

12、（氰酸胍，異硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 陰性對照,逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄引物選擇 下游應用：是否檢測其它基因？ Abundant RNA的干擾：mRNA or total RNA？ 檢測靈敏度是否足夠？,RT-PCR一步法還是兩步法？,兩步法: 反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增分兩步進行。 步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留檢測 多個基因。便于反應優(yōu)化。在工作的初期。,一步法：反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增在同一管內(nèi)完成。 簡便、快捷但只做一個基因，一旦失敗 難以查找原因。在工作的成熟階段。,熒光定量PCR體系,Template Primers DNA聚合酶 Buffer an

13、d dNTPs Dye,總原則與普通PCR相同： 避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu) 擴增片段長度（80 - 300bp) 推薦做跨intron設計,引物設計原則,Master mix,使用Master mix有效降低系統(tǒng)誤差 - 熱啟動酶 Hotstar 化學修飾，低溫下酶活抑制性強，熱復活需10min Fast Hotstar 抗體修飾，熱復活僅需幾十秒 - Buffer 反應增強劑 減少模板二級結(jié)構(gòu)影響 控制Mg2+濃度 穩(wěn)定劑 - Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mix,Master mix的優(yōu)化,新型熒光染料(Super Green) 激發(fā)、發(fā)射波長與SY

14、BR Green近似 對PCR反應抑制更輕微 可使用較高濃度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，靈敏度更高 較短的鏈延長時間 對小片段DNA和ssDNA結(jié)合更弱 減少背景，有效信號更強 與更強的信號協(xié)同，使溶解曲線峰更窄，適合于HRM分析 化學性質(zhì)更穩(wěn)定 致突變性與毒性更弱,Master Mix,ROX Passive Reference 不參與、不干擾PCR反應 恒定發(fā)射熒光信號 用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導致的系統(tǒng)誤差。 有不同系統(tǒng)，需參照儀器要求選擇。,誤差控制 使用Master mix 配置預混體系 設置生物學重復（不同個體） 技術性重復（復孔） 陽性和陰性

15、對照,實驗環(huán)境控制 試劑準備區(qū) 核酸制備區(qū) 反應液制備區(qū) 熒光定量PCR反應區(qū),熒光定量PCR體系,數(shù)據(jù)分析,融解曲線：單一特異性產(chǎn)物 擴增曲線： - Ct值大小 - 各復孔之間重復性 - 不同濃度梯度稀釋的間隔性 標準曲線： - R20.980或 r 0.990 - 反應效率盡可能高：90%-110% - 目的基因的擴增效率接近內(nèi)參基因,操作注意事項,為避免加樣誤差，保證重復性，配制預混體系 配制反應體系時，液體要緩慢加至管底，減少吹打 低速離心，充分混勻，如有氣泡短暫離心 不要直接在八連管上進行標記 避光保存，試劑分裝避免反復凍融 酒精擦拭移液器的吸頭 設置反應重復（至少二個） 設置對照,

16、案例分析 總體原則,偶然因素 - 操作原因 實驗重復 生物學重復、技術性重復 機器因素 儀器加樣孔 結(jié)合擴增曲線、融解曲線、標準曲線分析 單孔和多孔分析 內(nèi)參基因和目的基因?qū)Ρ确治?案例分析 擴增曲線,曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯。 擴增曲線整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象。 模板進行梯度稀釋時，各濃度間隔性好。,Ct 15-35 重復性,擴增曲線 - 低濃度樣本沒有稀釋好 - 重復性差，加樣存在誤差,案例分析 擴增曲線,案例分析 擴增曲線,無信號或Ct值偏大 內(nèi)參基因和目的基因均無信號 - RNA降解 內(nèi)參基因和目的基因均偏大 - 模板量低 - 對未知濃度的樣品應從稀釋最高濃度做

17、起 內(nèi)參基因正常，而目的基因偏大或無信號 - 引物設計 - 目的基因表達量低,案例分析,Q內(nèi)參基因與目的基因的Ct值之差在多大范圍內(nèi)可以接受？ A： - 在使用2-Ct法計算的前提是，公式成立的條件是內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率相接近并且足夠高，在90%-110%之間，因此內(nèi)參基因與目的基因的差值是可以接受的。 - 內(nèi)參基因和目的基因的Ct值在15-35以內(nèi)，并且重復管之間的重復性很好，這樣的數(shù)據(jù)都是可以接受的。,案例分析 擴增曲線,擴增曲線不平滑 - 樣本濃度太低 - 原始信號弱,關閉ROX校正信號,案例分析 擴增曲線,擴增曲線很早揚起 - 樣本濃度太高 （稀釋樣品濃度）,案例分析 熔解曲線,熔解曲線出現(xiàn)雙峰 引物峰：