ICS

G

中華人民共和國(guó)中華人民共和國(guó)國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)家標(biāo)準(zhǔn)

GB29690—2013

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

動(dòng)物性食品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量

的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

DeterminationofmarkerresiduesofNicarbazininanimalderivedfood

byLiquidChromatography-tandemMassSpectrometricmethod

（電子版本僅供參考，以標(biāo)準(zhǔn)正式出版物為準(zhǔn)）

2013-09-16發(fā)布2014-01-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

I

目目次次

目次.....................................................................................................................................................I

前言....................................................................................................................................................II

動(dòng)物性食品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法...................................１

1范圍..................................................................................................................................................１

2規(guī)范性引用文件..............................................................................................................................１

3原理..................................................................................................................................................１

4試劑和材料......................................................................................................................................１

5儀器和設(shè)備......................................................................................................................................２

6樣品的制備與保存..........................................................................................................................３

6.1樣品的制備.................................................................................................................................３

6.2樣品的保存.................................................................................................................................３

7測(cè)定步驟........................................................................................................................................３

7.1提取與凈化...................................................................................................................................３

7.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備.........................................................................................................................３

7.3測(cè)定.............................................................................................................................................４

7.4空白試驗(yàn).....................................................................................................................................５

8結(jié)果計(jì)算和表述............................................................................................................................５

9檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度..............................................................................................６

9.1靈敏度.........................................................................................................................................６

9.2準(zhǔn)確度.........................................................................................................................................６

9.3精密度.........................................................................................................................................６

附錄A..................................................................................................................................................７

II

前前言言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)系國(guó)內(nèi)首次發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

１

動(dòng)物性食品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量的測(cè)定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物性食品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物4,4-二硝基苯縮脲殘留量檢測(cè)的制樣和液相色譜-

串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于雞的肌肉組織和雞蛋中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物4,4’-二硝基均二苯脲殘留量的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有

的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方

研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理原理

試料中殘留的4,4-二硝基苯縮脲，用乙腈提取，正己烷除脂，75％甲醇水溶液萃取，液相色譜-串

聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

4試劑和材料試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭?；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.14,4’-二硝基均二苯脲對(duì)照品：含量≥98.0％。

4.24,4’-二硝基均二苯脲-D8對(duì)照品：含量≥98.0％。

4.3乙腈：色譜純。

4.4甲醇：色譜純。

4.5無(wú)水硫酸鈉

4.6正己烷

4.7乙酸銨

２

4.8二甲基甲酰胺

4.90.1mol/L乙酸銨溶液：取乙酸銨1.93g，用水溶解并稀釋至250mL。

4.1075％甲醇水溶液：取甲醇75mL，用水溶解并稀釋至100ml。

4.1175％甲醇水溶液飽和的正己烷取75％甲醇水溶液100mL，加正己烷100mL，搖勻，靜置分層，

取上層液。

4.121mg/mL4,4’-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液精密稱取4,4’-二硝基均二苯脲對(duì)照品10mg，于10

mL量瓶?jī)?nèi)，用二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/mL的4,4’-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)

貯備液。2～8℃保存，有效期3個(gè)月。

4.1310μg/mL4,4’-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取1mg/mL4,4’-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)貯備液

1.0mL，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/mL的4,4’-二硝基均二苯脲

標(biāo)準(zhǔn)工作液。-18℃保存，有效期3個(gè)月。

4.141mg/mL4,4’-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取4,4’-二硝基均二苯脲-D8對(duì)照品10mg，

于10mL量瓶?jī)?nèi)，用二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/mL的4,4’-二硝基均二苯

脲-D8標(biāo)準(zhǔn)貯備液。2～8℃保存，有效期3個(gè)月。

4.1510μg/mL4,4’-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取1mg/mL4,4’-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)

貯備液1.0mL，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/mL的4,4’-二硝基均

二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)工作液。-18℃保存，有效期3個(gè)月。

5儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。

5.2分析天平：感量0.00001g。

5.3天平：感量0.01g。

5.4渦旋振蕩器

5.5離心機(jī)

5.6氮吹儀

5.7離心管：50mL。

5.8濾膜：0.2μm。

３

6試料試料的制備與保存的制備與保存

6.1試料的制備

6.1.1雞蛋

取適量新鮮或冷藏的空白或供試雞蛋，去殼，并使均質(zhì)。

——取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。

6.1.2雞肌肉

取適量新鮮或冷凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。

——取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。

——取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。

6.2試料的保存

-20℃以下保存。

7測(cè)定步驟測(cè)定步驟

7.1提取與凈化

稱取試料（2±0.02）g，于50mL離心管中，添加10μg/mL4,4’-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)工作液適

量，加無(wú)水硫酸鈉2g，乙腈8mL，渦旋0.5min，超聲5min，5000r/min離心10min，取上清液，于40℃

氮?dú)獯蹈?，?5％甲醇水溶液飽和的正己烷1mL，渦旋10s，再加75％甲醇水溶液1.0mL，充分渦旋

混合，于40℃水浴中靜置5min，2000r/min離心5min，取下層清液，濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)

譜測(cè)定。

7.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取10μg/mL4,4’-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)工作液和10μg/mL4,4’-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)工

作液適量，用75%甲醇水溶液稀釋，配制成4,4’-二硝基均二苯脲-D8濃度均為100ng/mL以及4,4’-二硝

基均二苯脲濃度為2、10、20、50、200和500ng/mL系列對(duì)照溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。以

特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

４

7.3測(cè)定

7.3.1液相色譜條件

色譜柱：C18（150mm×2.1mm，粒徑5μm），或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：甲醇＋0.1mol/L乙酸銨溶液（75＋25，v/v）；

流速：0.2mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：20μL。

7.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；

掃描方式：負(fù)離子掃描；

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；

電離電壓：3.0kV；

源溫：110℃；

霧化溫度：350℃。

錐孔氣流速：50L/h；

霧化氣流速：450L/h；

定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1DNC和內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量

藥物

定性離子對(duì)

m/z

定量離子對(duì)

m/z

錐孔電壓

V

碰撞能量

eV

DNC

300.9＞136.9

300.9＞136.920

18

300.9＞106.932

DNC-D8309.0＞141.0309.0＞141.02018

7.3.3測(cè)定法

取試樣溶液和對(duì)照溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法，以峰面積比計(jì)算。試料溶液及對(duì)照溶液

中4,4’-二硝基均二苯脲及4,4’-二硝基均二苯脲-D8的峰面積比應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試樣溶

液中的離子相對(duì)豐度與空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子相對(duì)豐度相比，符合表2的要求。對(duì)照溶液和空白添

加試樣溶液中各特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄A。

表2試料溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍

５

相對(duì)豐度

%

允許偏差

%

＞50±20

20～50±25

10～20±30

≤10±50

7.4空白試驗(yàn)

除不加試料外，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。

8結(jié)果計(jì)算和表述結(jié)果計(jì)算和表述

單點(diǎn)校準(zhǔn):

iS

SiS

iSS

iS

CAA

CCAA

C

或標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)：由b

C

C

a

A

A

iS

S

iS

S

求得a和b，則)b

A

A

(

a

C

C

iS

iS

試料中DNC殘留量（μg/kg）：按下式計(jì)算：

m

CV

X

式中:

X——供試試料中4,4’-二硝基均二苯脲的殘留量，μg/kg；

C——試樣溶液中4,4’-二硝基均二苯脲的濃度，ng/mL；

Cis——試樣溶液中4,4’-二硝基均二苯脲-D8的濃度，ng/mL；

Cs——對(duì)照溶液中4,4’-二硝基均二苯脲的濃度，ng/mL；

C′is——對(duì)照溶液中4,4’-二硝基均二苯脲-D8的濃度，ng/mL；

A——試樣溶液中4,4’-二硝基均二苯脲的峰面積；

Ais——試樣溶液中4,4’-二硝基均二苯脲-D8的峰面積；

As——對(duì)照溶液中4,4’-二硝基均二苯脲的峰面積；

A′is——對(duì)照溶液中4,4’-二硝基均二苯脲-D8的峰面積；

V——溶解殘余物所用75％甲醇水溶液的體積，mL；

６

m——供試試料質(zhì)量，g。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

9.1靈敏度

本方法的檢測(cè)限為0.5μg/kg，定量限為1μg/kg。

9.2準(zhǔn)確度

本方法雞蛋試料在1～10μg/kg添加濃度、雞肌肉試料在1～300μg/kg添加濃度水平上的回收率

為80%～120%。

9.3精密度

本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。

７

附錄附錄A

（資料性附錄）

4ng/mLDNCstd21-Feb-2008

Time

2.004.006.008.0010.00

%

0

100

2.004.006.008.0010.00

%

0

100

2.004.006.008.0010.00

%

0

100

DNC080221_05MRMof3ChannelsES-

309>141

1.24e4

4.50

DNC080221_05MRMof3ChannelsES-

300.9>136.9

9.17e3

4.59

DNC080221_05MRMof3ChannelsES-

300.9>106.9

756

4.62

3

圖A14,4’-二硝基均二苯脲及內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖（4ng/mL）

muscleblank

Time

0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00

%

0

100

0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00

%

0

100

0.001.0