1、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定方法概述,1,學習交流PPT,目錄,2,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳技術是實驗室進行蛋白質(zhì)研究中最常用的技術，兼有電泳和分子篩的雙重作用。 SDS是一種陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)變性，與其蛋白質(zhì)結合成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合體，消除電泳過程中蛋白質(zhì)所帶電荷對電泳結果的影響，從而保證蛋白質(zhì)電泳僅受分子質(zhì)量大小的影響。在一定的電場作用下，該復合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠形成的分子篩向電場的正極移動，從而將蛋白質(zhì)根據(jù)他們的分子量大小而分開。 蛋白質(zhì)-SDS復合體：形狀一定、電荷密度一定,3,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,上樣：防止樣品溢出、

2、正負極、電壓,4,學習交流PPT,SDS-PAGE凝膠電泳,當?shù)鞍踪|(zhì)分子量在10-200kDa時，樣品的遷移率和分子量的對數(shù)呈對數(shù)關系，符合如下方程式： lgMW = -bRf + K 其中，MW為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，Rf為相對遷移率，b為斜率，K為截距，當條件一定時，b和K為常數(shù)。 因此通過已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比較，就能得出未知蛋白的分子量。,5,學習交流PPT,影響分子量測定的因素很多，包括蛋白質(zhì)與SDS的結合量的不同，凝膠濃度和交聯(lián)劑濃度等，如圖所示。研究者測定了當交聯(lián)劑濃度不變，改變凝膠濃度，下圖分別對應于凝膠濃度為5%，10%，15%。,SDS-PAGE凝膠電泳,6,學習交

3、流PPT,優(yōu)點：操作簡單，容易掌握，成本低，分辨率高，重復效果好。 缺點：對于電荷異?；蛘邩嬒螽惓５牡鞍?、帶有較大輔基的蛋白及一些結構蛋白測定的分子質(zhì)量不太可靠，而且電泳結束后還需要染色，染色，脫色比較耗時。,SDS-PAGE凝膠電泳,7,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,定義：又叫體積排阻層析、分子篩層析，當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行的分離技術。 固定相：惰性凝膠顆粒，顆粒內(nèi)部立體網(wǎng)狀結構，形成許多孔穴 原理：,8,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠（Sepharose）,9,學習交流P

4、PT,凝膠滲透層析法,洗脫體積Ve與分子量的關系可用下式表示： Ve=K1K2logMW （K1、K2為常數(shù)，MW為分子量） 從公式可以看出，目標樣品的流出體積與分子量對數(shù)成線性關系。在實際操作過程中，選取標準品與樣品同時通過凝膠柱，通過已知標準品的流出體積和分子量可以計算出曲線中的K1、K2值，再根據(jù)已知的曲線方程和樣品流出體積計算樣品的分子量。,10,學習交流PPT,凝膠滲透層析法,優(yōu)點：操作簡單，設備簡單，樣品用量少，周期簡單，條件溫和，一般不引起生物活性的改變。 缺點：應用具有一定的局限性，在pH68的范圍內(nèi)，線性關系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量

5、超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。,11,學習交流PPT,質(zhì)譜法,1906年，Thomson發(fā)明了質(zhì)譜技術，最初只是用于無機化學中的同位素分析，直至20世紀40年代末才發(fā)展成為有機質(zhì)譜。近年來，生物質(zhì)譜技術取得了突飛猛進的發(fā)展，其中以分別由美國科學家John.B.Fenn和日本科學家田中耕一發(fā)明的電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術（MALDI-MS）的貢獻最為突出。 可準確測定分子量,12,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）,原理：電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電

6、壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷密度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質(zhì)譜技術。ESI-MS測定蛋白質(zhì)大分子是根據(jù)一簇多電荷的質(zhì)譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質(zhì)的分子量，由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰，因此使得測試的分子質(zhì)量范圍大大擴大。,13,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）,電噴霧是一種離子化方法，可以用作質(zhì)譜儀的離子源,14,學習交流PPT,1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）,多電荷使得樣品譜圖復雜 荷質(zhì)比：,15,學習交流PPT,

7、1.電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）,優(yōu)點： （1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費； （2）對樣品分子質(zhì)量測試靈敏度、分辨力和準確度都相當高； （3）能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。 缺點： 對樣品純度要求高，且會形成多電荷的質(zhì)譜峰群，難以分辨，使得結果分析較為困難。,16,學習交流PPT,2.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術（MALDI-MS）,原理：基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量后，

8、均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化。 將它與經(jīng)典的脈沖化工作方式的飛行時間質(zhì)譜儀（TOF）直接聯(lián)用，即我們常聽到的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。,17,學習交流PPT,2.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術（MALDI-MS）,優(yōu)點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少； （2）MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過ESI-MS； （3）有利于對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮

9、發(fā)成分，降低了對樣品預處理的要求； （4）MALDI-TOF 質(zhì)譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣。 缺點：在與高效液相色譜、毛細管電泳等分離設備的聯(lián)用時，目前只能采取離線的方式，致使分析結果的重復性較差，與MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。,18,學習交流PPT,其他方法,除了以上幾種目前實驗室常用的測定方法，還有一些現(xiàn)在在實驗室一般不太使用的方法，包括粘度法，滲透壓法，輻射失活法，超速離心沉降法，光散射法等。,19,學習交流PPT,1.粘度法,粘度法是指通過測定樣品溶液的粘度，從而計算樣品的的分子量的方法。一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性

10、，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現(xiàn)出的特性粘度也大。 特性粘度與相對分子量M之間遵循Mark-Houwink經(jīng)驗方程： =KM。K和值與溫度、聚合物、溶劑性質(zhì)有關，也和分子量大小有關。,20,學習交流PPT,2.滲透壓法,在一種理想溶液中，滲透壓與溶質(zhì)濃度成正比。 但是實際上蛋白質(zhì)溶液與理想溶液有較大的偏差。 滲透壓法測定蛋白質(zhì)分子量靈敏度較低，測定誤差較大，與SDS-PAGE法和凝膠色譜法等相比不常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。,21,學習交流

11、PPT,3.輻射失活法,輻射失活法無需純化和溶解蛋白質(zhì)，可在原位測定其分子量。高能射線照射生物組織會產(chǎn)生電離作用，若在一定范圍內(nèi)輻射能量破壞蛋白質(zhì)分子的C-H鍵，使蛋白質(zhì)喪失功能，電離作用減少。 D：輻射能量 輻射失活法作為一種獨特的蛋白質(zhì)分子量測定方法，具有獨特的優(yōu)點，尤其是在膜蛋白研究方面，提供了一個測定膜蛋白分子量和研究其結構的手段，但由于高能射線使用的局限性，在生化研究中不常用。,22,學習交流PPT,4.超速離心沉降法,利用超速離心沉降法測蛋白質(zhì)的分子量是在較低轉(zhuǎn)速下進行的（8000-20000r/min）。離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，一段時間以后，沉降的結果造成了濃度梯度，因而產(chǎn)生了蛋白質(zhì)分子反向擴散運動，當反向擴散與離心沉降達到平衡時，濃度梯度就固定不變了，但是目前由于操作繁瑣，已經(jīng)不在一般實驗室使用。,23,學習交流PPT,5.光散射法,主要基于染料陰離子在蛋白質(zhì)等電點前與肽鏈上帶正電荷的基團上的結合作用。此時生色團聚集于蛋白質(zhì)分子上引起共振散射光增強，它與核酸不同的是生色團必須是帶負電荷的陰離