1、06:24:13,第5章 其它色譜方法,06:24:13,紙層析和柱層析法薄層色譜,高效毛細(xì)管電泳,超臨界流體色譜,06:24:13,紙層析,06:24:13,一、紙層析分離過程,紙層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。,紙層析流動相的移動是依靠毛細(xì)作用。 將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點(diǎn)時，帶動試樣向上運(yùn)動。 Rf 值相差越大，分離效果越好,06:24:13,二、操作技術(shù),1.層析紙和層析板 特制的色層濾紙。按需要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑

2、（硅膠或氧化鋁，200250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。,06:24:13,2.展開劑,由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。,06:24:13,3. 點(diǎn)樣,用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個試樣同時展開。,06:24:13,4.顯色、檢測,有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。,06:24:13,三、特點(diǎn)及應(yīng)用,平板色譜簡單、方便、及操作費(fèi)

3、用低， 可以在一塊層析板上同時展開多個試樣及將多條濾紙同時展開。 采用方形薄層板還可以方便的進(jìn)行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進(jìn)一步改善分離效果。 試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。,06:24:13,缺點(diǎn)： 分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。定性定量不便。 應(yīng)用：平板色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸堿類化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)及中草藥中有效成分的分離分析中經(jīng)常被使用。也可以用于無機(jī)離子的分離。還經(jīng)常作為高效液相色譜的一種預(yù)試方法。,06:24:13,柱層析,06:24:13,柱層析：是吸附色譜的一種，它利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的

4、組分逐一洗脫分離的一種分離方法。 微型柱層析實(shí)驗(yàn),06:24:13,實(shí)例:,凝膠過濾層析純化細(xì)胞色素C,06:24:13,一、目的要求,1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。 2.通過凝膠過濾柱層析對細(xì)胞色素C進(jìn)行純化,06:24:13,二、原理 凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。,06:24:13,06:24:13,優(yōu)點(diǎn)： a. 條件溫和 b.操作簡便 c. 損失少回收率高 d. 層析柱可反復(fù)使用 凝膠的類型： Sephadex: 交聯(lián)葡聚糖 Sepharose：瓊脂糖凝膠 Bio-Gel A Bi

5、o-Gel P：聚丙烯酰胺凝膠分子篩 Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠,06:24:13,凝膠及柱的選擇,06:24:13,凝膠的處理及裝柱 凝膠干粉的溶脹（熱溶脹）、浮選、抽氣、裝柱、藍(lán)色葡聚糖檢查、平衡 裝柱時要注意操作壓。,06:24:13,裝柱的兩種方法： a.手工操作 1/3床體積水加入少許凝膠積起1-2厘米凝膠床打開出水口連續(xù)緩慢加入凝膠 b.電動攪拌下的裝柱法,06:24:13,樣品上柱 分析用量：柱床體積的12% 制備用量：柱床體積的2030% 洗脫收集 部分收集器、核酸蛋白檢測儀 凝膠的保存方法 0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰,06:24:1

6、3,三、試劑與器材 試劑：0.01mol/l Tris-HCl緩沖液，PH7.5，含0.2mol/l NaCl 器材：層析柱、部分收集器、核酸蛋白質(zhì)檢測儀 、記錄儀,06:24:13,（二）裝柱 1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。 2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。 （三）凝膠柱的平衡 通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上

7、放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保護(hù)凝膠上端有一段液體。,06:24:13,（四）加樣 1.準(zhǔn)備好部分收集器、核酸蛋白檢測儀及記錄儀 2.打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將細(xì)胞色素C樣品溶液1 mL小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1 mL洗脫液沖洗管壁2次。最后加入34 mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連。 （五）洗脫 洗脫

8、時，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.025 mol/LTris-HCl，以每管3 mL/10 min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。,06:24:13,06:24:13,六、注意事項(xiàng) 1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。 2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。 3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。,06:24:13,薄層層析法（TLC）,06:24:13,引言,歷史： 薄層層析法TLC：50 年代后在紙層析和柱層析的基礎(chǔ)上發(fā)

9、展起來 1951年J.G.kirchner首先對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究 1958年E.Stahl對薄層層析用的吸附劑和涂層工具進(jìn)行改進(jìn)并使之標(biāo)準(zhǔn)化，克服了技術(shù)上的困難，使TLC獲得迅速發(fā)展 定義： TLC是把固定相吸附劑鋪在玻璃板上鋪成均勻的薄層，把試液點(diǎn)在層析板（即薄層）的一端試樣中各組分就被吸附劑所吸附，由于薄層的毛細(xì)管作用，展開劑沿著吸附薄層上升，試樣溶解在展開劑中，在固定相和流動相之間不斷的發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。 優(yōu)點(diǎn)： 快速，做一次薄層層析只需10-60min； 分離效率高；靈敏度可達(dá)0.01g； 層析后可用各種方法顯色，甚至可噴強(qiáng)腐蝕性的濃硫酸，可高溫灼熱； 應(yīng)用面

10、廣，可以進(jìn)行定性及定量測定 對于各種試劑，可選用不同的吸附劑和展開劑 可做吸附層析、分配層析以及離子交換層析。 薄層層析法,06:24:13,原理,展開劑在薄層中的流速與展開劑的表面張力、粘度及吸附劑的種類、粒度、均勻度等等因素有關(guān)，即和層析系統(tǒng)（固定相和流動相）有關(guān)，也和展開距離有關(guān)。 塔板理論亦可應(yīng)用于TLC中，將塔板高度和展開距離聯(lián)系起來。 TLC中層析效率同樣可用分離度表示。 Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。 當(dāng)Rf=0.33時，Rs值最大，分離最好。 選擇合適的吸附劑和展開劑是TLC分離能否獲得成功的關(guān)鍵。,06:24:13,原理,吸附劑 ：最常用的是氧化鋁和硅膠。 展開劑

11、：可用單一的溶劑并且還常常把各種溶劑按不同比例混合配 成混合溶劑以作展開劑。 鋪層：干法鋪層-簡單快速、隨鋪隨用，但不能保存，易被吹散。分 離效果差。層析展開較快。 濕法鋪層-常用有傾倒法、刮層法、涂鋪器鋪層法。 點(diǎn)樣：需用易于揮發(fā)、極性和展開劑相似的溶劑溶解試樣以得到 0.5-1%的試液?？捎妹?xì)管或微量注射器把試樣點(diǎn)成小圓 點(diǎn)或長條。力求快速 展開：上行法-常用 干板近水平方向展開 硬板采用近垂直方向展開 下行法-比上行法快，但分離效果較差。,06:24:13,SW-86,過去的TLC,06:24:13,現(xiàn)代平面色譜,06:24:13,應(yīng)用1 傳統(tǒng)中藥中糖的分析,糖廣泛存在于中草藥中，干重

12、占整個植物的80-90% 中藥中多糖的分析在制藥上有非常重要的意義 TLC可以用來純化測量和從寡糖、多糖中確認(rèn)單糖,06:24:13,應(yīng)用2低分子量化合物快速成像,TLC-MALDI-TOFMS對微量分析展開以及原位操作有高速度和選擇性。對于低分子量分析物，基質(zhì)的背景離子常引起嚴(yán)重的干擾。 使用UV吸收質(zhì)子給體離子液體（Et3N-CHCA）作為基質(zhì)分析低分子量物質(zhì)如生物堿Arborescidine A、B、C，麻醉劑Levobupivacaine、Mepivacaine和抗體Tetracycline。,06:24:13,應(yīng)用3 TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂多糖LPSs）和Lipid

13、 A,內(nèi)毒素LPSs的混合物，其脂結(jié)構(gòu)域 稱為Lipid A，與多種生物活動相 關(guān)，沒有O鏈的LPSs稱為粗型LPS 使用TLC，選用合適的溶劑在硅膠 上選擇性的萃取分離完整細(xì)胞的LPS 組分，所得分子物種的譜帶在無損傷 成像后從板上刮下來直接和基質(zhì)混 合，用 MALDI-TOFMS進(jìn)行分析 基質(zhì)加入檸檬酸極大改善譜圖 TLC直接從細(xì)胞中萃取分離出LPSs 并進(jìn)行表征，快速、靈敏，可用于結(jié) 構(gòu)和血清分析。,06:24:13,應(yīng)用4 TLC-VC-MALDI MS分析神經(jīng)節(jié)苷脂,神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于動物細(xì)胞外膜表面，代謝、生物合成、生理性質(zhì)均引起人們注意。其中TLC是分析這類糖脂混合物以及其生物

14、行為的標(biāo)準(zhǔn)工具17-18。TLC和MS偶聯(lián)起來可以滿足結(jié)構(gòu)分析 使用1-10mbar達(dá)到振動冷卻（vibrational cooling）即用TLC-VC-MALDI-FTMS分析神經(jīng)節(jié)苷脂,Vera B. Ivleva etc. Anal. Chem.2004, 76, 6484.,TLC-VC-MALDI-FTMS聯(lián)用樣品處理簡單，可以二維成像 傅里葉變換有高分辨率和準(zhǔn)確度，可以更好的分析結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié) 外置離子源可規(guī)避TLC板的不規(guī)則表面引起的分辨率和準(zhǔn)確度的降低 TLC板還可直接與MALDI相連，不需對分析物進(jìn)行再次萃取。,06:24:13,5 TLC板熒光成像分析神經(jīng)節(jié)苷脂,Tomohir

15、o Hayakawa等人利用100C以下僅有唾液酸發(fā)熒光的特征，通過熒光成像定量測定神經(jīng)節(jié)苷脂 神經(jīng)節(jié)苷脂上唾液酸濃度與熒光強(qiáng)度的線性范圍47pM-4.5nM TLC板上的熒光成像分析可以測量更寬范圍的神經(jīng)節(jié)苷脂 通過調(diào)整加熱溫度，可分析糖脂類物質(zhì)。該方法簡單、低廉、重現(xiàn)性好、不需特殊試劑、不需熒光標(biāo)記，可以定量測定。,Tomohiro Hayakawa; Mitsuhiro Hirai Anal. Chem.2003, 75, 6728.,06:24:13,進(jìn)展,解析電噴霧電離（DESI）是新的大氣壓解析電離方法 DESI主要應(yīng)用于表面分析，TLC可以通過DESI和MS偶聯(lián),06:24:13

16、,總之,TLC省時、省原料，可以同時分析多種樣品。耗資少，所需儀器少，所需操作培訓(xùn)少，它是一種平面的分離手段，極易和MALDI-MS(基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜法 )聯(lián)用，甚至可以在原位分析多種物質(zhì)，也有許多嘗試應(yīng)用不同的電離源來進(jìn)行結(jié)構(gòu)和定量測定，在許多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用前景。,06:24:13,高效毛細(xì)管電泳,一、高效毛細(xì)管電泳基本原理 二、儀器裝置 三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法 四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用,06:24:13,高效毛細(xì)管電泳儀器（1）,06:24:13,高效毛細(xì)管電泳儀器（2）,06:24:13,高效毛細(xì)管電泳儀器（3）,06:24:13,一、高效毛細(xì)管電泳基本原理,在電解質(zhì)溶液中，

17、位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。,1.經(jīng)典電泳分離法的不足 所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。 高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。,06:24:13,2.高效毛細(xì)管電泳技術(shù)上的重要突破,高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,； 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。 電壓升高，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱

18、長增加， 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。,06:24:13,3.電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象,電泳現(xiàn)象： 帶電離子在電場作用下的遷移，速度電泳,電滲流現(xiàn)象：玻璃表面存在硅羥基, pH3時, 形成雙電層，在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動，速度電滲流。,06:24:13,4. 分離過程,電場作用下，柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。,帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反，電滲流 電泳時,陰

19、離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。,06:24:13,5.分離類型,八種分離類型 (1) 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） 最普遍、最基本的一種分離模式。,(2) 毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。可分離測定蛋白質(zhì)、DNA等。,06:24:13,(3) 毛細(xì)管膠束電動色譜（MECC）,在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。由于

20、電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長。可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。,06:24:13,二、儀器裝置,電壓：030KV。 分離柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器 （可檢測到：10-1910-21 mol/L）,06:24:13,三、影響柱效的因素及改進(jìn)方法,熱效應(yīng)：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。,電

21、滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢的極性和大小。,使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑。則可以改變電滲流的方向。,06:24:13,四、主要特點(diǎn)和應(yīng)用,高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。 高靈敏度：可檢測出低至10-21 mol/L濃度的物質(zhì)。 高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì). 試樣用量少：僅需幾nL（10-9 L）的試樣 儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液。,不足之處： 進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對較窄。 分析

22、陰離子時，由陰極進(jìn)樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動方向相反，出峰時間較長。,06:24:13,超臨界流體色譜,一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理 feature and principle of SFC 二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)流程 structure and general process of SFC 三、超臨界流體色譜的應(yīng)用 application of SFC,supercritical fluid chromatograph, SFC,06:24:13,Berger(產(chǎn)地：美國)超臨界流體色譜儀(SFC),06:24:13,JASCO(產(chǎn)地： 日本)超臨界色譜儀(S

23、FC),06:24:13,一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理principle and character of supercritical fluid chromatography,1.概述 超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):,（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣； （2）比LC有更高的柱效和分離效率。,06:24:13,2. 超臨界流體性質(zhì),（1）性質(zhì)介于液體和氣體之間; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間。 （2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。,06:24:13,3.原理,SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；,06:24:13,壓力效應(yīng)：,SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對分離有影