1、第十八章 重組DNA技術 Chapter 18 Techniques of Recombinant DNA, DNA分子體外重組技術和核苷酸序列分析技術標志了基因工程時代的誕生。, 1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen首次成功 實現DNA分子的體外重組。, 1977年，Frederick Sanger 和 Walter Gilbert 發(fā)明了DNA測序法。, 重組DNA技術 (recombinant DNA technique)：指在體外重新組合DNA分子，并使它們在適當的細胞中增殖的遺傳操作。, 遺傳工程(Genetic Engineering)：借助生物學技術

2、，對生物遺傳物質進行更改和/或重新組合，以改變生物的遺傳性狀或創(chuàng)造新的生物品種的遺傳學研究技術。, 遺傳工程有廣義和狹義之別，狹義遺傳工程專指重組DNA技術(即基因工程)，廣義遺傳工程包括細胞水平的遺傳操作(也稱細胞工程)和基因工程。, 克?。菏怯⑽摹癱lone ”或“cloning 的音譯，源于希臘文“Klone”，本意為無性繁殖系，即通過無性繁殖而產生的完全相同的子代集合體。,重組DNA技術的基本步驟,第 一 節(jié) 重組DNA技術中的酶 Section 1 Enzymes in DNA Recombination,重組DNA技術中常用工具酶,一、限制性核酸內切酶(restriction en

3、zyme ),1. 定義 限制性內切酶：又稱限制性核酸內切酶，能識別結合雙鏈DNA分子中的特異序列，并切割DNA。,3. 限制酶的分類 根據作用特征可以分為型、型和型三種類型 (1) 三型限制酶的基本特征, 型：具有內切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，能識別和結合于特定的DNA序列位點，但隨機切斷在識別位點以外的DNA序列（通常在識別位點周圍400700bp）。, 型：具有內切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，切割位點距離識別位點約25bp。,(2) 型限制性核酸內切酶, 只由一條肽鏈組成，不具有甲基修飾酶活性， 不需要ATP 識別位點一般為4 6堿基對組成的特異性序列。 切

4、割后可產生粘性末端，也可產生平頭末端。,二、DNA連接酶(DNA ligases), 常用的連接酶為T4連接酶，既可以連接粘性末端，也可以連接平頭末端。, 溫度是影響連接反應效率的重要因素，通常在426進行連接反應。,不同類型的限制性內切酶的切點性質以及粘端之間的退火,第二節(jié) 載 體 Section 2 Vectors, DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導入宿主細胞進行自主復制的特定DNA分子。, 克隆載體用于克隆基因或DNA片段的載體。 用于表達一個基因則稱為表達載體。 載體的特點：,(1)含有復制起始點 (2) 體積小,(3) 不能插入到基因組中，易于分離和純化 (4) 含有選擇

5、性標記 (5) 含有克隆位點 (5) 具有適當的長度, 表達載體則除了上述特征外，還應在所要表達的基因上游具有轉錄啟動子，下游有轉錄終止子等；很多表達載體還具有核糖體結合位點。,一、克隆載體,1. 質粒載體 通常為天然質粒的人工改良DNA。 (1) pBR322,為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有如下特點： 帶有一個復制起始位點 具有Ampr和Tetr二個抗性基因，可插入失活 具有較小的分子量(4.36kb) 可插入較大外源片段 (6kb) 拷貝數較高(可達10003000),質粒pBR322示意圖,(2) pUC系列質粒 由pBR322改建而成，主要特征為：, 有復制起始位點(ori，源于p

6、BR322) Ampr基因(酶切位點不再單一) 含有Lac Z基因 含有多克隆位點區(qū)段, pUC系列大多數是成對的，如pUC8/pUC9、 pUC18/pUC19,pUC18/19質粒的基本結構, pUC系列質粒的優(yōu)點： 具有更小的分子量和更高的拷貝數 適應于組織化學篩選重組體(藍白斑實驗) pUC系列提供多克隆位點(MCS),2噬菌體載體, 常用于大片段DNA的克隆，實驗中以噬菌體、M13和粘粒最為常用,3. 人工染色體, 人工染色體(artificial chromosomes)：由染色體的復制元件構建的載體，是為克隆更大片段的DNA而發(fā)展的新型載體。, 人工染色體主要包括三種：細菌人工染

7、色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和哺乳動物人工染色體(MAC), YAC載體的復制元件包括：復制起點序列(即自主復制序列，ARS)、著絲粒(centromere , CEN)和兩個端粒(TEL)。,二、表達載體,根據表達載體的結構特點： 原核表達載體 酵母表達載體 昆蟲細胞表達載體 哺乳動物細胞表達載體 植物細胞表達載體等,1. 原核表達載體,(1) 原核表達載體的結構特點： 強啟動子 常用啟動子：Lac啟動子、Trp啟動子、T7噬 菌體啟動子 轉錄終止子： T7終止子等 SD序列：提供核糖體的結合位點,(2) 原核表達載體表達特點： 非融合型表達蛋白 融合型表達蛋白 分泌型表達蛋白,

8、T7啟動子,Lac操縱序列,rbs (SD序列),T7終止子,MCS,His標簽,His標簽,凝血酶位點,pET-28a-c(+) 克隆表達區(qū)結構特征,2. 酵母表達載體, 一般為質粒型穿梭載體。, 選擇性標志, 通常利用營養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標記，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。, 復制子, 通常利用啤酒酵母2m環(huán)質粒的復制起始序列。, 常用的啟動子,常用的酵母基因啟動子：醇脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MF)。,(1) 酵母表達載體的結構特點, 上游活性序列, 上游活性序列的功能類似于增強子，可促進轉錄。, 終止序列,

9、 可終止轉錄，還可增加mRNA的數量和蛋白質表達的總量。, 特定蛋白結構域, 如信號肽序列和核定位序列等。,(2) 酵母表達載體的表達形式, 直接表達, 分泌性表達, 外源蛋白質表達后積累于酵母細胞質中，如人乙型肝炎表面抗原的表達。, 外源蛋白質表達后在信號肽指導下分泌至細胞外，信號因子通常為因子前導序列，Invitrogen公司的酵母表達載體pGAPZ屬于此種類型。,3. 哺乳動物表達載體, 哺乳動物細胞表達外源蛋白的優(yōu)勢是可被修飾。, 常用的哺乳動物細胞表達宿主： 中國倉鼠卵巢細胞(CHO) 猴腎細胞(COS)等, 哺乳動物細胞表達載體一般為穿梭型載體，含有真核細胞表達相應序列，如Invi

10、trogen公司開發(fā)的pcDNA3.3-TOPO。,哺乳動物表達載體pcDNA3.1,第 三 節(jié) 重組DNA操作的基本過程 Section 3 Protocols of DNA Recombination,DNA重組的基本過程： 1. 靶基因DNA片段的制備 2. 適宜載體的選擇和制備 3. DNA片段與載體的連接 4. 重組DNA轉化宿主細胞 5. 含有重組DNA宿主菌的篩選 6. 重組DNA分子的鑒定,基因組DNA,質粒載體,限 制 酶,目的基因序列,重組后含有外源基因的載體,DNA 連接酶,轉化,擴增,重組DNA技術的基本步驟,一、目的DNA片段的制備, 來源與方法：基因組DNA、cDN

11、A、PCR產物和化學合成的DNA。, 基因文庫(gene library)：也稱基因組文庫(genome library)，用限制酶切割基因組DNA獲得成千上萬的在一定大小范圍內的DNA片段，每一個DNA片段與載體分子連接，產生一個重組DNA分子的混合物，重組DNA分子轉化宿主菌后，每一個轉化細胞含有一個重組DNA分子，這些克隆的集合體被稱為基因文庫。,基因組文庫的構建, cDNA文庫(cDNA library)：提取細胞總mRNA，經反轉錄獲得總cDNA，每一個cDNA分子與載體連接產生了一個重組DNA分子的混合物，再轉化宿主菌，每個宿主菌細胞克隆將含有一個cDNA重組分子，這些克隆的集合體

12、被稱為cDNA文庫。, 若目的序列全部已知，可以通過人工合成的方法獲取靶序列。, 已知目的序列兩端序列時，可以通過PCR方法獲取靶序列。,cDNA文庫的構建,二、載體的選擇與準備, 選擇原則：依據重組DNA的目的，選擇適當載體。,適合的選擇標記,三、DNA分子的體外重組, 互補性粘性末端將使連接更容易。,限制酶粘性末端連接 T-載體粘性末端連接 平末端連接 同聚物加尾連接 人工接頭連接,Bam H切割反應,T4 DNA連接酶 15C,限制酶粘性末端連接,目 錄,目 錄,平末端鏈接,3. 同聚物加尾連接 在末端轉移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物

13、序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。,載體DNA,目的基因,限制酶或機械剪切,限制酶,目 錄,4. 人工接頭(linker)連接 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。,人工接頭及其應用,目 錄,四、重組DNA分子導入宿主細胞,1. 轉化, 轉化(transformation)：質粒DNA分子導入細菌宿主，并使其獲得新表型的過程。,三種方法：轉化、轉染和感染。, 感受態(tài)細胞(competent cell)：指經過處理后變得更容易接受外源DNA的細菌細胞。如使用CaCl2處理E. coli細胞，可獲得E. coli的感受態(tài)細胞。,2. 轉染, 轉染(transfe

14、ction)：將重組DNA分子轉入真核細胞的過程。, 轉染細胞：接受了外源DNA分子的宿主細胞。, 穩(wěn)定轉染(stable transfection)：進入宿主細胞的DNA分子整合到宿主細胞基因組中。, 瞬時轉染(transient transfection)：進入宿主細胞的DNA分子游離于宿主染色體之外。, 轉染方法：常用磷酸鈣法和脂質體法。,3. 感染, 感染(infection)：以病毒或噬菌體為載體的重組DNA分子，在體外經過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，感染適當的細胞，并在細胞內擴增，也稱為轉導(transduction)。,五、重組子的篩選與鑒定,1. 載體的抗藥性標志,抗

15、氨芐青霉素基因(Ampr) 抗四環(huán)素基因(Tetr) 抗卡那霉素基因(Kanr)等,2. 載體抗藥性標志插入失活選擇, 一般選用含有兩個以上抗藥基因的載體，外源DNA插入其中一個抗藥基因，并導致該基因失活。如pBR322質粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamH I)。,(插入失活法) 抗藥性標記選擇,目 錄,3.-互補法 (即藍白斑篩選法),質粒 -肽 (無半乳糖苷酶活性),-肽-肽 (半乳糖苷酶活性),宿主 -肽 (無半乳糖苷酶活性),X-gal,X (藍色產物),+ gal(半乳糖), 互補的檢測,組氨酸缺陷 型大腸桿菌,無組氨酸 的培養(yǎng)基,酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因,促進組氨酸合成

16、,DNA,重組體,4. 營養(yǎng)缺陷型的互補篩選,5. 核酸分子雜交篩選, 通過原位雜交、Southern 印跡和 Northern印跡分析轉化子。,根據插入序列設計探針,與轉化子克隆進行雜交,有雜交信號的為陽性克隆,6. PCR法進行鑒定,根據插入序列設計PCR引物,以轉化子的重組DNA為模板進行PCR擴增,電泳分析PCR產物,根據PCR產物長度判斷陽性克隆，還可結合PCR產物測序進行更精確的分析,7. DNA序列分析鑒定, 直接進行DNA測序，精確分析陽性克隆。, 對陽性重組轉化子的精確鑒定一般先選擇前6種方法之一進行初步分析后，再進行DNA測序分析。,第 四 節(jié) 外源基因的蛋白質表達 Sec

17、tion 4 Expression of Recombinant Gene, 重組基因表達體系的創(chuàng)建過程包括： 表達載體的構建 受體細胞的建立 表達產物的分離、純化等技術。, 根據宿主細胞的不同可分為： 原核表達體系 真核表達體系,一、原核表達體系,1. 不同表達方式的優(yōu)缺點,(1) 非融合型表達 優(yōu)點：與真核生物體內蛋白質結構最相似，功能 最相近。 缺點：容易被細菌蛋白酶所破壞。,(2) 融合型表達 優(yōu)點：可以抵御細菌蛋白酶的破壞，融合蛋白比 天然的外源蛋白更加穩(wěn)定, 缺點：需要去除原核多肽。 原核多肽切除方法：化學裂解法和酶解法。,(3) 分泌表達 優(yōu)點：防止大腸桿菌對表達產物的降解，減輕

18、大腸 桿菌代謝負荷和恢復表達產物天然構象。, 包涵體益處：防止蛋白酶對表達蛋白的降解，有利于表達產物分離純化。, 包涵體缺點：表達蛋白不具有生物活性，必須溶解包涵體并對表達蛋白進行復性。,2. 包涵體(inclusion body), 是大腸桿菌高效表達外源基因時形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與細胞質中的其他成分有明顯的區(qū)別。,二、真核表達體系,1. 酵母表達體系 (1) 酵母表達體系具有諸多優(yōu)點：, 可以對蛋白進行多種翻譯后修飾 培養(yǎng)簡單 自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表達系統(tǒng) 具有較高的安全性，如啤酒酵母表達體系 分離純化的過程比較簡單,(2) 酵母表達體系實例 干擾素、人表皮生長因子、人乙型肝炎表面抗原 和核心抗原等。,2. 哺乳動物細胞表達體系 優(yōu)點： 可表達克隆的cDNA，也可表達真核基因組 DNA。 表達蛋白可被適當修飾。, 缺點： 操作技術難 費時 成本高,三、重組蛋白質分析鑒定,重組蛋白質的鑒定方法及標準,四、重組蛋白質藥物制備, 生物制藥領域的上游技術包括基因克隆、表達載體構