1、一、DNA的限制性酶切實驗原理,實驗三 質(zhì)粒DNA限制性酶切圖譜分析,核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來的侵襲。 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的片段端為，端為。,根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。 第一類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如Ec

2、oB、EcoK等。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,第三類（型）限制性內(nèi)切酶就是通常指的限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈產(chǎn)生種

3、不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)進行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。,1. 限制性內(nèi)切酶的類型,一、DNA的限制性酶切實驗原理,粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。 如EcoRI的識別順序為： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一

4、種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。,平頭末端：,用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。 用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。,2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法,一、D

5、NA的限制性酶切實驗原理,由 pUC18改造而來，大小為 3162bp 。相當(dāng)于在 pUC18中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進入噬菌體顆粒所必需的順式序列。,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理,瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就

6、可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。,二、瓊脂糖凝膠電泳實驗原理,（1）瓊脂糖含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。 （2）電泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。 （4）樣品易回收，常用于制備。,瓊脂糖電泳的優(yōu)點,配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。,瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍,

7、常用的電泳緩沖液,4 保存?zhèn)溆?,常用的6X載樣緩沖液, 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液,三 材料、設(shè)備及試劑,質(zhì)粒 ：pUC118、pEGFP 設(shè)備 ：eppendorf管、微量取液器，臺式高速離心機，電泳儀、電泳槽、UVP凝膠成像系統(tǒng)、微波爐 試劑：瓊脂糖 、TAE電極緩沖液、Lamdar DNA EcoR I/Hind、 EB、加樣緩沖液,四、操作步驟,1、質(zhì)粒DNA的限制性酶切反應(yīng) （1）、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管編號,用微量移液槍分別加入DNA 5l， 10緩沖液2l,BSA 2u

8、l，EcoRI 1ul，ddH2O 10ul，用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。 （2）、混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37水浴保溫1小時,使酶切反應(yīng)完全。 （3）、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?2、瓊脂糖凝膠電泳 (1)稱取0.25g瓊脂糖，置25ml電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解； (2)待溶液冷至60，加入2ul SYBR Green I。 (3)在距離膠模底板0

9、.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡； (4)凝膠完全凝固后，移去梳子和擋板，將凝膠放入電泳槽。加入TAE緩沖液使恰好沒過膠面約1mm； (5)將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中； (6)接通電源，使樣品槽在負(fù)極端，用80V的電壓，至溴酚藍到膠前沿時，停止電泳。 (7)凝膠自動處理系統(tǒng)（UVP）觀察和拍照，記錄結(jié)果。 樣品：DNA5ul、6X點樣液2 ul，電極緩沖液5ul pUC118、pEGFP、 pUC118/ EcoRI 、 pEGFP/ EcoRI 、細菌基因組DNA DNA Marker (2ul，6X點樣液2 u

10、l，電極緩沖液5ul ),內(nèi)切酶： 不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端； 內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，通常 1u指在適當(dāng)條件下，1小時內(nèi)完全酶解ug特定底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以ug DNA對u酶短時間為宜。 同時內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內(nèi)切酶活力； 內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影

11、響限制性內(nèi)切酶的活力。 這種抑制可通過： 增加酶作用單位數(shù)（1020U/ug DNA）、 增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑 或延長反應(yīng)時間加以克服。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,：,反應(yīng)緩沖液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基； TrisHCl維持反應(yīng)體系pH值在7.2-7.6之間； NaCl濃度不同形成種級別的離子強度： 低鹽（10mM NaCl) 中鹽（50mM NaCl） 高鹽（100mM NaCl） 不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,反應(yīng)緩沖液：,大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為，如EcoR, Hind, BamH, Pst等，

12、也有如Bcl需在下進行反應(yīng)， 反應(yīng)時間根據(jù)酶的單位與用量之比來定，原則是酶：=：,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,酶解溫度與時間：,小時即可，充分酶解。,五、注意事項DNA凝膠電泳,1.瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。 2.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。 3.電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應(yīng)常更新電泳緩沖液。,4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5g的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣

13、孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定。當(dāng)加樣孔大時，樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大，否則會造成條帶淺甚至辯認(rèn)不清；反之則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。 5. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。,五、注意事項DNA凝膠電泳,內(nèi)切酶失活 DNA不純，含有SDS，酚，ED

14、TA等內(nèi)切酶抑制因子 條件不適（試劑、溫度） DNA酶切位點上的堿基被甲基化 DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I） DNA位點上存在其它修飾 DNA不存在該酶識別順序,標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性 將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴增 將DNA底物與DAN混勻進行切割驗證 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,問題一：DNA完

15、全沒有被內(nèi)切酶切割,原 因,對 策,內(nèi)切酶活性下降 內(nèi)切酶稀釋不正確 DNA不純，反應(yīng)條件不佳 內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 部分DNA溶液粘在管壁上 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) 酶切后DNA粘末端退火 由于反應(yīng)溶液、溫度、強烈振蕩使內(nèi)切酶變性 過度稀釋使酶活性降低 反應(yīng)條件不適 識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序,用5-10倍量過量消化 用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 同上 同上 反應(yīng)前離心數(shù)秒 將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強烈振蕩 適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 使用最佳

16、反應(yīng)體系 加大酶量5-10倍,問題二：DNA切割不完全,原因,對 策,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,內(nèi)切酶星狀活性 其它內(nèi)切酶污染 底物中含其它DNA雜質(zhì),檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量 用DNA作底物檢查酶切結(jié)果 電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段,問題三：DNA片段數(shù)目多于理論值,原因,對 策,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,DNA定量錯誤（如RNA含量較高） 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀,用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 在反應(yīng)前透析DNA樣品或用

17、酒精沉淀二次,問題四：酶切后沒有觀察到DNA片段的存在,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,保存溫度不合適 以稀釋形式保存 貯藏緩沖液不適當(dāng) 低蛋白濃度,內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在-20低溫保存 稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存,問題五：內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì) 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶,減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶,問題六：電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一,原因,對 策,五、限制性內(nèi)切

18、酶酶切常見問題分析,含磷酸鹽的濃度高 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶 平末端連接 外切酶污染 連接緩沖液不合適,透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA 加大T4 DNA Ligase用量 減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA 重新配制連接緩沖液,七、DNA電泳常見問題分析,問題七：酶切后的DNA片段連接效率低,原因,對 策,DNA降解 電泳緩沖液陳舊 所用電泳條件不合適 DNA上樣量過多 DNA樣含鹽過高 有蛋白污染 DNA變性,避免核酸酶污染 電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液 電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力 減少凝膠中DNA上樣量 電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽 電泳前酚抽提去除蛋白 電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA,七、DNA電泳常見問題分析,問題一：DNA帶模糊,原因,對