1、2.4 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn),2.4.1 原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn),大腸桿菌DNA復(fù)制起始點(diǎn)（OriC）保守序列分布圖,OriCin E.colichromosomal DNA,2.4.1.1 DNA雙螺旋的解旋,由大腸桿菌oriC復(fù)制起始點(diǎn)處引發(fā)的DNA復(fù)制過(guò)程,(1)單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）,T4噬菌體的32 kDa蛋白可以結(jié)合單鏈DNA，它還能使雙鏈DNA在遠(yuǎn)低于解鏈溫度時(shí)分開(kāi)。 大部分原核SSB蛋白與DNA結(jié)合時(shí)還表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：如第一個(gè)SSB蛋白結(jié)合到DNA上去的能力為1，第二個(gè)SSB結(jié)合能力則可高達(dá)103。 SSB蛋白的作用是穩(wěn)定單鏈DNA。,(2)DNA解鏈酶（D

2、NA helicase）,大部分DNA解鏈酶都沿滯后鏈模板的53方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有Rep蛋白沿前導(dǎo)鏈模板的35方向移動(dòng)。 因此，Rep蛋白和其他DNA解鏈酶分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用，解開(kāi)雙鏈DNA。,Replication of SV40 DNA,2. 4. 1. 3 復(fù)制的引發(fā)和終止,DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈，那么，新DNA的復(fù)制是怎樣開(kāi)始的呢？ 研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3端開(kāi)始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過(guò)程比較復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，

3、還牽涉到岡崎片段的形成和連接。,滯后鏈的引發(fā)過(guò)程由引發(fā)體（primosome）來(lái)完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n、n、Dna B、C和I共同組成，只有當(dāng)引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功能。 引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上間斷性引發(fā)生成滯后鏈引物-RNA短鏈，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹?。由RNase H降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補(bǔ)齊，再由DNA連接酶將兩個(gè)岡崎片段連在一起形成大分子DNA。,鏈的終止需要Tus蛋白參與,當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20b

4、p重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。,鏈的終止（Termination）,2.4.1.4 DNA聚合酶,大腸桿菌中主要有DNA聚合酶I、II、III。,表2-10 大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較,DNA聚合酶的共同點(diǎn)：,1、都以dNTP為底物。2、都需要Mg2+激活。3、聚合時(shí)必須有模板鏈和具有3OH末端的引物鏈。4、鏈的延伸都方向?yàn)?3。 DNA聚合酶I不是復(fù)制大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有53核酸外切酶活性，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。它也可用來(lái)除去

5、岡崎片段5端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來(lái)。,DNA聚合酶II的活性很低，若以每分鐘酶促核苷酸摻入DNA的轉(zhuǎn)化率計(jì)算，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是復(fù)制中主要的酶。目前認(rèn)為DNA聚合酶II的生理功能主要是起修復(fù)DNA的作用。 DNA聚合酶III包含有7種不同的亞單位和9個(gè)亞基，其生物活性形式為二聚體。它的聚合活性較強(qiáng)，為DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。它能在引物的3OH上以每分鐘約5萬(wàn)個(gè)核苷酸的速率延長(zhǎng)新生的DNA鏈，是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延長(zhǎng)反應(yīng)的主導(dǎo)聚合酶。,2.4.2 真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn),真核生物DNA的復(fù)制子被稱(chēng)為ARS（auto

6、nomouslyreplicating sequences），長(zhǎng)約150bp左右，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/秒。因此，人類(lèi)DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。,真核細(xì)胞中有5種DNA聚合酶，分別稱(chēng)為DNA聚合酶、和。,DNA聚合酶的主要作用： DNA聚合酶主要參與引物合成。 DNA聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。 DNA聚合酶是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶。 DNA聚合酶的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補(bǔ)全。,The mechanism of telomere extension by te

7、lomerase Reverse,2. 4. 3 DNA復(fù)制的調(diào)控（了解）,DNA鏈延伸的速度在同種生物的不同細(xì)胞中幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)量不同。 迅速分裂的細(xì)胞具較多的復(fù)制叉，而分裂緩慢的細(xì)胞復(fù)制叉較少并出現(xiàn)復(fù)制的間隙。 復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和RNA。,ColEl質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控,ColEl是一個(gè)6646堿基對(duì)的小質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)有2030個(gè)拷貝，其DNA的復(fù)制完全依靠宿主DNA聚合酶。 質(zhì)粒DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA（RNA1），它們控制了起始DNA復(fù)制所必需的引物合成。,ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制起始部位調(diào)控因子之間關(guān)系,大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控,染色體的復(fù)制與分裂一般是同步的，但二者并不直接偶聯(lián)。 在一定生長(zhǎng)速度范圍內(nèi)，細(xì)胞與染色體的質(zhì)量之比相對(duì)恒定。 復(fù)制子由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部分組成。起始物位點(diǎn)編碼復(fù)制體調(diào)節(jié)蛋白，復(fù)制起點(diǎn)與調(diào)節(jié)蛋白相互作用并啟動(dòng)復(fù)制。調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)與復(fù)制復(fù)合物的相互作用確定復(fù)制起始頻率和復(fù)制方式。 復(fù)制起點(diǎn)有OriC和OriH兩種。,真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控,細(xì)胞生活周期水平調(diào)控（限制點(diǎn)調(diào)控）：決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期(by Cyclins, Cdc(Cel