1、第二章 DNA的結(jié)構(gòu),第一節(jié) 遺傳物質(zhì)的本質(zhì) 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 第三節(jié) DNA的二級結(jié)構(gòu) 第四節(jié) DNA的物理化學(xué)性質(zhì) 第五節(jié) 超螺旋和拓撲異構(gòu),第一節(jié) 遺傳物質(zhì)的本質(zhì),a、編碼蛋白質(zhì)和RNA的信息(編碼tRNA、 rRNA),64個三聯(lián)體密碼子 3個終止密碼子 編碼氨基酸的61個密碼子有簡并性、通用性,一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息,b、編碼基因選擇性表達的信息,基因選擇性表達表現(xiàn)在： 細胞周期的不同時相中 個體發(fā)育不同階段 不同的器官和組織 不同的外界環(huán)境下基因的表達與否以及量的差異,* 原核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很大,x174phage 5386bp 結(jié)構(gòu)基因用去51

2、69bp 比例達96,* 真核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很小,哺乳動物中結(jié)構(gòu)基因只占1015,其余80以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達的遺傳信息,所以又稱調(diào)控序列,二、 RNA也可作為遺傳物質(zhì),* RNA病毒 傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質(zhì)外殼） 如: 煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus ，TMV),* 類病毒（viroid）: 使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子 分子結(jié)構(gòu)：含246375 個核苷酸的單鏈環(huán)狀RNA 分 子，沒有蛋白質(zhì)外殼。專性活細胞內(nèi)寄生。,三、 是否存在核酸以外的遺傳物質(zhì),Pr

3、ion (proteinaccous infections particle) 朊病毒蛋白質(zhì)樣的感染因子,羊搔癢病 (scripie),人類庫魯（ kuru） 病,牛海綿狀腦炎(瘋牛病),均由傳染性病原蛋白顆粒引起,統(tǒng)稱Prion (朊病毒),Prion 復(fù)制? 轉(zhuǎn)錄? 翻譯?,人類朊病毒疾病、癥狀及發(fā)病機理,致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退化,病理表現(xiàn)：大腦皮層的神經(jīng)原細胞退化、空泡變性、死亡、消失，最終被星狀細胞取代，因而造成海棉狀態(tài),朊病毒帶來了諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎 1997 Stanley B.Prusiner,發(fā)現(xiàn)朊病毒是作為老年性癡呆癥等疾病的病原并能在寄主細胞中繁殖傳播,第二節(jié) 核酸的化

4、學(xué)組成,嘧啶 Pyrimidines,嘌呤 Purines,一、 堿基、核苷、核苷酸, 堿基 Nitrogenous bases, 核苷（nucleotide）,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脫氧核糖核苷,1,9, 核苷酸（nucleotide acid）,核苷的磷酸酯 脫氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,其中和、和之間是高能磷酸鍵,dNTP,堿基戊糖核苷 核苷磷酸核苷酸,核糖核苷三磷酸縮寫為NTP,二、DNA分子的一級結(jié)構(gòu) (DNA sequence),1、 多聚核苷酸鏈 主鏈是核糖和磷酸 側(cè)鏈為堿基,由3,5磷酸二酯鍵連接,2、 鏈的方向：同一個磷酸基 的3

5、酯鍵到5酯鍵的方向 (53),5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默認書寫順序53,第二節(jié) DNA的二級結(jié)構(gòu),* 1953. Watsosn & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,一、 DNA雙螺旋模型的提出（double helix model）,* 雙螺旋的主鏈,磷酸二酯鏈 (Phosphodiester Backbone),C-G,T-A,堿基互補, 直徑20,* 雙螺旋模型參數(shù), 螺距為34（任一條鏈 繞軸一周所升降的距離）, 每圈有10個核苷酸 （堿基）, 有大溝和小溝 配對堿基并不充滿雙 螺旋空間，且堿基對 占據(jù)的空間不對稱, 兩個堿

6、基之間的垂直 距離是3.4。螺旋轉(zhuǎn) 角是36度,Major Groove,Minor Groove,10.4 bp/turn,Twist 36, 大、小溝的差異, 大溝中堿基差異容易識別 ，往往是蛋 白質(zhì)因子結(jié)合特異DAN序列的位點, 小溝相對體現(xiàn)的信息較少,二、 影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素,l 氫鍵 (Hydrogen bond 46 kc / mol),消除DNA單鏈上磷酸基團間的靜電斥力,弱鍵, 可加熱解鏈,氫鍵堆積, 有序排列(線性, 方向),l 磷酸酯鍵 (phosphoester bond 8090 kc / mol),l 0.2 mol / L Na+ 生理鹽條件,強鍵, 需酶促

7、解鏈,* 維持穩(wěn)定性的因素,l 堿基堆積力 (非特異性結(jié)合力),( 1 kc / mol 0.6kc / mol ) n, 范德華力（Van de waals force） (1.7A/ 嘌呤環(huán)與嘧啶環(huán) 作用半徑),(0.34 nm/堿基對間距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非極性分子在水中相互聯(lián)合, 成串結(jié)合的趨勢力.,(磷酸骨架, 氨基, 酮基周圍水分子間的有序排列 ),l 磷酸基團間的靜電斥力,堿基內(nèi)能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞 而減弱,* 不穩(wěn)定因素,三、雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本形式, B-DNA 資料來自相對濕度為92所得到

8、的DNA鈉鹽纖維, 此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋 Z構(gòu)象等形式,DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及同 一種雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)參數(shù)存在差異的現(xiàn)象,原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉(zhuǎn)動的單鍵 磷酸二酯鍵的兩個P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個鍵,A,B,Z,A,B,Z,大溝寬,小溝窄,小溝窄,大溝變深,小溝寬淺,大溝不存在,小溝窄而深,1、反向重復(fù)序列與二級結(jié)構(gòu) 反向重復(fù)序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR） 又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時存 在于一個分子中，但具有相反的方向

9、有時也有不完全相同的情況 RNA和DNA中都可能存在 此外還可有directed repeatitive sequence -正向重復(fù)序列,四、一些DNA序列的不尋常結(jié)構(gòu),C,反向重復(fù)序列間間隔較短或無間隔,反向重復(fù)序列間間隔較長,* 較短的回文序列可能是作為一種信號 如：限制性內(nèi)切酶的識別位點 一些調(diào)控蛋白的識別位點,例如限制性內(nèi)切酶 EcoR的識別位點 5GAATTC3 3CTTAAG5,（1） 形成條件,一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈 如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT),2、三螺旋DNA (Trible H

10、elix DNA, T.S DNA),可能與基因調(diào)控區(qū)域的功能和染色體重組有關(guān),D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA,（2） 組成形式,b、分子組成 PY/PU + PU (偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定) GG 、 AA 、 GA PY/PU + PY (偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定) 常見類型 GC AT,第三條鏈位于B-DNA的 Major groove中,H-DNA,兩種異構(gòu)體,T. S. DNA 的連接鍵,Watson bonding A T G C (D. S. DNA),H+,Hoogsteen 氫鍵 G C+(質(zhì)子化 ) (第三鏈 , pH 小于7),三股螺旋DN

11、A結(jié)構(gòu)特點總結(jié),第三條單鏈DNA分子 位于B-DNA大溝內(nèi),與B-DNA以 Hoogsteen 鍵連接,poly(Py) : (Pu) : (Py)為常見類型,* 可能功能 可能與基因調(diào)控區(qū)域的功能和染色體重組有關(guān),3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),均有形成 四股螺旋DNA 的可能,形成條件串聯(lián)重復(fù)的鳥苷酸, 已有實驗結(jié)果表明真核細胞端粒中存在四鏈結(jié)構(gòu),結(jié) 構(gòu) 特 點,堿基之間靠 Hoogsteen 鍵連接,基本結(jié)構(gòu)單元鳥嘌呤四聯(lián)體,可能的功能,A、 穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu),B、 保證DNA末端準確復(fù)制,C、 與DNA分子的組裝有

12、關(guān),D、 與染色體的 meiosis & mitosis 有關(guān),第四節(jié) DNA的物理、化學(xué)性質(zhì),DNA雙股鏈的互補 是其結(jié)構(gòu)和功能上的一個基本特征 也是DNA研究中一些實驗技術(shù)的基礎(chǔ),一、DNA分子的變性,變性（denaturation 或融解 melting）：DNA雙螺旋區(qū)的 氫鍵斷裂，使雙螺旋的兩條鏈完全分開變成單鏈，這 一雙鏈分離的過程叫做變性,1、條件：加熱, 極端pH,有機溶劑（ 尿素、 酰胺 )，低鹽濃度等,2、變性過程的表現(xiàn) 是一個爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很 窄的溫度范圍 導(dǎo)致一些理化性質(zhì)發(fā)生劇烈變化,表現(xiàn)為： 熔液黏度降低 沉降速度加大 浮力密度上升 此外吸收值升

13、高（A260nm），即增色效應(yīng) 指在DNA變性的過程中，他在260nm的吸收值先是緩慢 上升，達到某一溫度時及驟然上升,天然DNA和變性DNA的吸收值相差可達34,當(dāng)濃度為 50g/ml時：,1.185,3、熔解曲線與融解溫度(Tm值) 緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現(xiàn)可做到 0.1 分）可根據(jù)各 點的A260值繪制成DNA 的熔解曲線,這也是一般PCR實驗技術(shù)中把變性溫度定為94 的原因,1、 影響 Tm值的因素,（1） 在 A, T, C, G 隨機分布的情況下 ，決定于GC含量,（2）GC%含量相同的情況下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成變性核心，變性加

14、快，Tm 值小,堿基排列對Tm值具有明顯影響,36.7 57.02 ,Tm,136.12 72.55 , 嘌呤嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)（穩(wěn)定性）的影響,即氫鍵數(shù)目相同，但相鄰堿基的堆積力不同 從嘌呤到嘧啶方向的堿基堆積力作用顯著地大于 同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的堿基堆積作用,Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking,5 CA 3 3 GT 5,Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking,5 AC 3 3 TG 5, 生物體內(nèi)僅UAA為最有效的終止密碼子,因為：,UAA,AU

15、U,的Tm值是最低的一個，即使生 理溫度下也不穩(wěn)定,（3） 大片段D.S DNA分子之間比較,片段長短對Tm值的影響較小, 與組成和排列相關(guān),（4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比較,片段愈短， 變性愈快，Tm值愈小,（5） 變性液中含有尿素，甲酰胺等,（6） 鹽濃度的影響 每升0.18mol Na+是常用的標準條件,思考題：室溫下蒸餾水中的DNA會如何？,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH2+ (質(zhì)子化),改變氫鍵的形成與結(jié)合力,（7） 極端pH條件的影響,一切減弱氫鍵， 堿基堆積力的因素 均將使Tm 值降低,2、 常用的變性方法, 熱變性, 堿變性,應(yīng)用廣泛，特

16、別是用于變性動力學(xué)研究,缺點：高溫引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈,pH11.3時，全部氫鍵被淘汰,無熱變性的缺點，為制備單鏈DNA的首選方法, 保存單鏈DNA的條件 保持pH大于11.3 鹽濃度低于0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,Denaturation , Renaturation,復(fù)性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ),二、DNA分子的復(fù)性 （anneal or renaturation）,概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙

17、螺旋結(jié)構(gòu)的過程（退火）,1、 影響DNA復(fù)性過程的因素 ：, S.S, DNA 的初始濃度 C0, DNA 分子中, 堿基的排列狀況 (隨機排列, 重復(fù)排列),3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,二、C0t曲線復(fù)

18、性發(fā)生過程的討論,dCt / dt = KC02,反應(yīng)初始 t = 0, 單鏈DNA的隨機碰撞 過程（ randomly collision ）,單鏈 DNA濃度 = C0,反應(yīng)達 t 時,單鏈DNA濃度 = Ct,K復(fù)性速度常數(shù),包括兩個因素：DNA的濃度（C，mol/L）和時間(s),dCt / dt = KC02 積分,Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ),當(dāng) Ct / C0 = 1/2 時,Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2),Ct/C0是C0t的函數(shù) 按此公式作圖得C0t曲線,基因組的復(fù)雜性單一序列的長度重復(fù)序

19、列的長度,復(fù)雜性的單位為核苷酸的數(shù)目,例如：含單一序列a, b, c, d,復(fù)雜性a+b+c+d,復(fù)雜性分子量,含106a, 103b, 10c, d,復(fù)雜性a+b+c+d,復(fù)雜性分子量,基因組的復(fù)雜性(genomic complexity),復(fù)雜性,* C0t和DNA的復(fù)雜性間存在線性關(guān)系： the more complex a DNA, the higher its Cot(1/2),1 :106 2105 :0.4 2109 :4000,A typical mammalian C0t curve has three plateaus,* C0t曲線能解釋單一來源的DNA所具有的不同復(fù)雜性

20、部分,真核生物的基因組由 高度重復(fù)（highly repetitive)序列、 中度重復(fù)（moderately repetitive or mid-repetitive) 序列 單一（single copy)序列組成,四、富含AT序列和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的呼吸作用, 高等生物染色體的某一區(qū)段，AT含量變化很大,很多有重要調(diào)節(jié)功能的的DNA區(qū)段都富含AT （原核、真核 復(fù)制起點、 啟動子、終止子等區(qū)域）, DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的呼吸作用：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部， 配對堿基的氫鍵的迅速斷裂和再生的過程, DNA內(nèi)富含AT區(qū)段呼吸作用尤為明顯 這對于某些特殊的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生反應(yīng)并閱讀鏈 內(nèi)部的信息具有重

21、要作用,第五節(jié) 超螺旋和拓撲異構(gòu),一、超螺旋（superhelix OR supercoil）,最早在SV40和多瘤病毒 中發(fā)現(xiàn), 超螺旋是所有線性或環(huán) 形DNA的共有的重要特征,The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.,1、 超螺旋結(jié)構(gòu)的方向性,正超螺旋（positive supercoiled ）,導(dǎo)致左手超螺旋,以一根繩

22、子做實驗： 原來的繩子的兩股以右旋方向纏繞；在繩子的一端向緊纏方向捻轉(zhuǎn)，再將繩子的兩端連接起來，則產(chǎn)生一個左旋的超螺旋以解除外加捻轉(zhuǎn)的協(xié)變,負超螺旋（Negative Supercoiled ）,導(dǎo)致右手超螺旋,在繩子的一端向松纏方向捻轉(zhuǎn)，再將繩子的兩端連接起來，則產(chǎn)生一個右旋的超螺旋以解除外加捻轉(zhuǎn)的協(xié)變,超螺旋的形成總是要向著抵消初級螺旋改變的方向發(fā)展,所有生物的DNA幾乎 有5%為 Negative Superhelix,二、超螺旋狀態(tài)的描述,1、可用數(shù)學(xué)公式描述,Vinograd 方程式,L = T + W ( = + ),L 連接數(shù)（Linking number ） 雙鏈DNA的交叉數(shù)

23、， 不發(fā)生鏈斷裂時，L為定值,T 盤繞數(shù)（Twisting number ） 雙鏈DNA的纏繞數(shù)，初級螺旋圈數(shù),W 超盤繞數(shù)（Writhing number） 直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動數(shù),W= 負值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix）,420bp,* B-DNA是 力學(xué)上穩(wěn)定 的結(jié)構(gòu) ( 10 bp/ helix),* 螺旋數(shù)改 變的結(jié)果之 一是產(chǎn)生超 螺旋 或是在 B_DNA中保 留一單鏈區(qū) 域，但須能量的功給, DNA在水溶液中, 構(gòu)型偏B型狀態(tài), DNA以10.5 bp/helix為最穩(wěn)定構(gòu)型, 小于10.5bp/helix 向正超螺旋發(fā)展(緊縮態(tài)), 大于10.5bp/helix 向負超螺旋發(fā)展(松弛態(tài)) 天然的DNA都是負超螺旋 但一些生命活動過程中存在正超螺旋,B-DNA的變化情況：,2、體外可產(chǎn)生正超螺旋 溴化乙錠（Ethidium bromide EB） 放線菌素D,a、EB的插入只改變盤繞數(shù)T使其降低 但L值不變,WLT L值不變 T值降低 W正值 產(chǎn)生正超螺旋,360o/