1、ELISA試驗方法的相關(guān)問題及質(zhì)量控制,酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 1971年由瑞典學(xué)者Engrall和Perlmann, 荷蘭學(xué)者Vanweeman和Schuurs報道。 開創(chuàng)了運用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中 微量物質(zhì)測定的實驗方法。,酶免疫技術(shù)的分類 酶免疫組化 酶免疫技術(shù) 均相酶免疫測定 酶免疫測定 液相酶免疫測定 異相酶免疫測定 固相酶免疫測定 （ELISA）,Ag + Ab* AgAb* + Ab* 均相法：抗原抗體反應(yīng)后AgAb* 中的標(biāo)記物失去特性， 不需進(jìn)行AgAb* 與 Ab*的分離，可直接測 定游離

2、的Ab*量，從而推算標(biāo)本中的Ag 量。 異相法：抗原抗體反應(yīng)后，需將AgAb* 與 Ab*，然后 測定AgAb* 或 Ab*的量，從而推算標(biāo)本中的 Ag 量。,ELISA方法的基本原理 （1）使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，并保 持其免疫活性。 （2）使抗原或抗體與酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體， 并保持抗原或抗體的免疫活性和酶的活性。 （3）酶標(biāo)的抗原或抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反 應(yīng)后，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶催化底物 形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物 質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的抗原或抗體 的量直接相關(guān)。,ELISA方法的基本類型 （一）雙抗體夾心法 （二） 間接法 （三） 競爭法,（一）雙抗體夾心

3、法,洗滌,洗滌,洗滌,待測抗原,（二）間接法,洗滌,洗滌,洗滌,待測抗體,酶標(biāo)抗抗體,（三）競爭法,洗滌,洗滌,待測抗原,酶標(biāo)抗原,雙位點夾心法,捕獲法,固相抗IgM,特異IgM,非特異IgM,標(biāo)本,特異抗原,抗原特異酶標(biāo)抗體,底物,ELISA試驗的方法學(xué)原理,一步法： Ab+Ag+Ab*AbAgAb* (a) AbAg (b) AgAb* (c) Ab*-AgAb (d),二步法 AbAg+Ab*AbAgAb* Ab*+AgAb*Ag (洗滌),ELISA方法的影響因素及控制,表面效應(yīng)(Surface effects) 蛋白質(zhì)分子在吸附過程中，為了克服與固相載體之間的排斥力需要重新分布其表面

4、的功能性基團(tuán)，使疏水性基團(tuán)充分暴露，然后局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德華引力而固相到載體表面。表面效應(yīng)可直接影響抗原、抗體的夠象和功能,固相導(dǎo)致抗原的變化 為了測定抗體的水平，需預(yù)先將抗原（包被）到極性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相蛋白質(zhì)抗原，可引起分子夠象和抗原性發(fā)生改變,固相對抗體的影響 將抗體固相化時，直接吸附法固相抗體分子，除了呈團(tuán)串狀，不均勻分布，易解吸等外，還可發(fā)生構(gòu)象改變，使抗體結(jié)合價減少甚至失活。,高劑量鉤鐮效應(yīng)(HD-Hook Effects) 發(fā)生在固相法試驗過程中的，可造成假低值甚至假陰性錯誤結(jié)果的特殊效應(yīng)，稱為HD

5、-Hook效應(yīng)。,邊緣效應(yīng)(Edge effects) 由于微量反應(yīng)板周邊孔與內(nèi)部孔升降溫速率的差別，造成周邊孔與內(nèi)部孔結(jié)果的差異，這就是邊緣效應(yīng)或位置效應(yīng),彌散效應(yīng)(Diffusion limits) 在固相法中抗原抗體結(jié)合，底物與酶的接觸，轉(zhuǎn)換的信號產(chǎn)物向液體內(nèi)彌散的過程中，液相與固相中的分子必須穿過液面的Nernst層，也就是液固屏障，使反應(yīng)速率受到限制。,干擾物質(zhì) 類風(fēng)濕因子 補體 嗜異性抗體 血清粘度過大、血脂過高 膽紅素、血紅蛋白 抗凝劑（肝素、EDTA） 酶類,類風(fēng)濕因子,類人血清中IgM、IgG型風(fēng)濕因子可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接 結(jié)合，導(dǎo)致假陽性

6、。 將熱變性IgG（63，10分鐘）加入到標(biāo)本稀釋液中。 用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。,補體,在固相化和標(biāo)記抗體的過程中，抗體FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露，使C1q可以將二者連接起來，造成假陽性。 用EDTA稀釋標(biāo)本。 用63，10分鐘或56，30分鐘加熱使C1q滅活。,嗜異性抗體,人類血清中含有能與齒齒類動物（鼠）Ig結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，造成假陽性。 在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig。,標(biāo)本溶血,標(biāo)本溶血可使紅細(xì)胞破壞溶解釋放出大量的具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，從而導(dǎo)致非特異性顯色。,標(biāo)本受細(xì)菌污染,菌體中含有內(nèi)源性辣根過

7、氧化物酶，被細(xì)菌污染的標(biāo)本，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記物的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色。,標(biāo)本保存不當(dāng),在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會造成假陽性。 標(biāo)本放置時間過長，有時抗原或抗體的免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。 5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放4，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存。,標(biāo)本凝集不全,在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液采集后1/22小時開始凝固，1824小時完全凝固。強行分離血清，血清中會有纖維蛋白原殘留，形成假陽性。 充分凝固后分離血清；用帶分離膠的采血管或采血管中加入抗凝劑。,添加物質(zhì)的影響,抗凝劑（如肝素

8、，EDTA）、酶抑制劑 （如NaN3)、分離膠等可干擾ELISA測定。,ELISA試驗的有關(guān)問題,洗滌液 洗滌的目的：除去未結(jié)合的免疫反應(yīng)物；終止抗原抗體的繼續(xù)結(jié)合；除去血清中與反應(yīng)無關(guān)的其它成份和游離的酶結(jié)合物；以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。,洗滌液的種類： 蒸餾水 吐溫-蒸餾水 吐溫-生理鹽水 PBS-吐溫-蒸餾水 Tris-吐溫-蒸餾水 （PH均為7.2或7.4）,Tween 20月桂酸 （液體） Tween 40棕櫚酸 （液體） Tween 60硬脂酸 （固體） Tween 80油酸 （液體）,閾值(Cut off值，陰陽界值) 進(jìn)行大量陰性標(biāo)本OD值的檢測，統(tǒng)計

9、陰性標(biāo)本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。 以X+SD為界值，一個標(biāo)本值小于此界值時，是陰性的可能性為68%。 以X+2SD為界值，一個標(biāo)本值小于此界值時，是陰性的可能性為95%。 以X+3SD為界值，一個標(biāo)本值小于此界值時，是陰性的可能性為99%。,為什么陰性標(biāo)本會略顯色而不是完全無色呢？ 由于目前分離、純化、檢測技術(shù)等方面的 限制，基因工程抗原和合成多肽都不可能達(dá) 到100%純度，往往含有2-5%的雜蛋白。同時 ELISA反應(yīng)板的非特異性吸附也不可避免。,陽性標(biāo)本不顯色,（2）基因工程抗原和合成多肽抗原的差別,ELISA試驗的影響因素及對策,靈敏度：能檢測到的分析物的最小量， 表示檢測下限的能力。 相對靈

10、敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）*100% 1）試劑盒（運輸時間太長、溫度太高） 2）試劑、樣品用前要平衡 3）試劑開啟時間長、長菌 4）吸液器吸量不足 5）恒溫箱不足37或溫育時間不足 6）洗滌方式不對 7）顯色劑加量不足 8）顯色反應(yīng)時間不足,重復(fù)性：對同一樣品重復(fù)分析的結(jié)果間的符合性 變異系數(shù)CV=SD/X*100%,1）樣品加入后未混勻 2）移液器加樣量不一致 3）洗滌方式不正確 4）唾液或其它雜質(zhì)掉入孔內(nèi) 5）酶或顯色劑B加量不一致 6）標(biāo)本處理不當(dāng) 7）酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差 8）保溫時間及顯色時間不一致 9）閾值附近的標(biāo)本,特異性：對陰性標(biāo)本給出陰性結(jié)果的能力 相對特異性=真陰性/（

11、真陰性+假陽性）*100%,1）配制洗液的蒸餾水污染 2）酶加量過多 3）洗滌不充分，樣品中其他成分殘 留或有酶殘留 4）顯色劑暴露時間太長 5）恒溫箱溫度失控 6）加酶或顯色劑后反應(yīng)時間過長 7）吸頭重復(fù)使用,室內(nèi)質(zhì)量控制,分析批：是一個區(qū)間（一段時間或測量樣 本量)預(yù)期在此區(qū)間內(nèi)檢測系統(tǒng) 的準(zhǔn)確度和精密度是穩(wěn)定的。 分析批長度 廠家推薦的批長度 用戶規(guī)定的批長度,質(zhì)控品 每一分析項目在用戶規(guī)定的分析批長度內(nèi)必 須檢測質(zhì)控品。 質(zhì)控品的成分應(yīng)與檢測患者樣本的基質(zhì)一樣 或相似。 質(zhì)控品應(yīng)均一、穩(wěn)定，瓶間變異性要小于分 析系統(tǒng)的變異。 質(zhì)控品不能作為校準(zhǔn)品使用。 質(zhì)控品可以自制也可購買成品。,ELISA測定每塊板都要測定室內(nèi)質(zhì)控品。 定性測定可采用弱陽性質(zhì)控品的s/co值作質(zhì)控圖。 定量測定參照臨床化學(xué)的繪制方法。 凝集試驗的室內(nèi)質(zhì)控品可采用試劑盒所帶的陰陽性對照。,ELISA檢測室內(nèi)質(zhì)量控制的方法,定值標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物 隨機陽性質(zhì)控物 自配定值質(zhì)控物,將某一質(zhì)控物連續(xù)測定20天，測算出其均值、標(biāo)準(zhǔn)差。 2SD為警戒值；3SD為失控。,定值標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物 衛(wèi)生