1、革蘭氏染色法,河南城建學院環(huán)境科學與工程實驗中心 環(huán)境生物技術(shù)實驗室,一 目的要求： 1、學習并初步掌握革蘭氏染色法。 2、了解革蘭氏染色法的原理極其在細菌分類 鑒定中的重要性。,二 基本原理： 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家Christain Gran 創(chuàng)立的，基本步驟是： 1、初染：結(jié)晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脫色：乙醇脫色 4、復(fù)染：番紅復(fù)染,經(jīng)此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。,Gram stain of Gram -,Gram stain of Gram +,實驗原理：細菌對革

2、蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫碘的復(fù)合物，增強染料與細菌的結(jié)合力。當用脫色劑處理時，革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔經(jīng)縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細胞被染上復(fù)染劑的紅色

3、。,Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall,三、器材： 大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，革蘭氏染色液， 載玻片，顯微鏡等 四、操作步驟： 1、涂片：將大腸桿菌（24h）和金黃色葡萄球菌 （24h）分別涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗 （2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋一分鐘，水洗 （3）脫色：將水甩凈，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約2030秒，立即用水沖凈乙醇 （4）復(fù)染：用番紅液染1-2分鐘，水洗,3、鏡檢：干燥后，

4、油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 4、混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。,步驟1：涂片,步驟2：干燥,步驟四 染色,步驟三 固定,crystal violet stain wash with water 結(jié)晶紫染色 水洗,Stain with grams iodine solution 碘液復(fù)染,Decolorize by adding 95% alcohol 95%酒精脫色,Counterstain with Safranin 沙黃復(fù)染,Results of stain 染色結(jié)果,五 注意事項1）注意涂片不宜過。2）火焰固定溫度要適宜。3）注意控制好脫色程度。,六、實驗報告： 1、結(jié)果：列表簡述2株細菌的染色觀察結(jié)果（形狀、顏色、革蘭氏染色反應(yīng)）。 2、思考題： 1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵步驟是什么？ 2）當你對