1、1,常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),第五章,2,第一節(jié) 光譜分析技術(shù) 第二節(jié) 電化學(xué)分析 第三節(jié) 電泳技術(shù) 第四節(jié) 層析技術(shù) 第五節(jié) 離心技術(shù) 第六節(jié) 自動(dòng)生化分析技術(shù) 只講第一節(jié)，其它內(nèi)容在臨床檢驗(yàn)儀器學(xué)中講授。,本章內(nèi)容概要,3,教學(xué)目標(biāo)和要求,1、掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。,2、熟悉分光光度計(jì)的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查 和波長校正、原子分光光度計(jì)的類型和影響熒光分析的 因素,3、了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中 的應(yīng)用。,4,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),分光光度技術(shù)的基本原理,分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),分光光度計(jì)的操作方法,分光光度技術(shù)的定性和定量方法,5,光譜分析技術(shù)原理

2、：,利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。,光譜分析技術(shù)分類：,發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法,吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光 度法和紅外光譜法,散射光譜分析技術(shù)：比濁法,6,一、分光光度技術(shù)的基本原理,（一）吸光度與透光度,A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I,當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱為透光度，即：,T = I/I0,T100為T%稱為百分透光度。透光度

3、的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度即：,7,（二）Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層 厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其 表達(dá)式為：,A = KLC,式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液 層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度,（Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）,8,據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)液層厚度為cm，濃度單位為mol/L時(shí)，吸光系數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)()。的意義是：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為1mol/L時(shí)在特定波長下的吸光度值。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。,9,（三）

4、偏離Lambert-Beer定律的因素,應(yīng)用Lambert-Beer定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學(xué) 和化學(xué)兩方面的因素。,1光學(xué)因素： 要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。,2化學(xué)因素： 濃度、pH、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。,10,二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu),最常用的是可見分光光度計(jì)和紫外-可見光分光光度計(jì),光源,單色器,比色杯,檢測(cè)器,顯示器,五大部份,結(jié)構(gòu)：,11,（一）光源,光源定義：,指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長有明顯的變化。,光源種類：,可見光分光

5、光度計(jì)常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。,紫外光光度計(jì)常用氫燈作為光源。,12,（二）單色器,定義：,將來自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分 光系統(tǒng)或單色器。,種類：,濾光片,棱鏡,光柵,13,（三）比色杯,又稱為吸收池或比色皿,材料：,常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成,（五）顯示器,（四）檢測(cè)器,檢測(cè)器是將透過溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將電信號(hào) 放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。,是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的 裝置。,14,三、分光光度計(jì)的操作方法,（一）分光光度計(jì)的基本操作,以721-A型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：,1.開721-A分

6、光光度計(jì)的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。 2.將波長旋至測(cè)定的波長。 3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。 4.將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上 比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。 5.將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.0 6.重復(fù)步驟4和5 7.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（A）,15,（二）吸光度的校正,鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在25，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波長下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測(cè)

7、儀器吸光度的準(zhǔn)確度。,16,四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法,（一）分光光度技術(shù)的定性方法,定性依據(jù)：,最大吸收波長max和摩爾吸光系數(shù),2.摩爾消光系數(shù)方法,1.最大吸收波長max方法,17,（二）分光光度技術(shù)的定量方法,1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法,根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按最小二乘法的原理，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。,方

8、法：,18,制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：,（1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新 繪制。,（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。,（3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。,（4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。,19,2比較法,Cu=(AuCs)/As,己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白， 同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn) 品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：,其中Cu和Au為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn) 管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量 和標(biāo)本管濃度相近。,20,3其它分析方法,包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析