1、溶血性貧血的實(shí)驗(yàn)室檢查,Laboratory diagnosis of hemolytic anemia,南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教研室 熊石龍 ,本章提綱,一、溶血性貧血定義和分類 二、溶血性貧血的確診試驗(yàn) 三、溶血性貧血原因的實(shí)驗(yàn)室檢查,貧血 外周血中單位容積內(nèi)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量或紅細(xì)胞比容（Hct）低于正常下限。,癥狀: 疲乏困倦； 氣促；心悸；食欲差，腹帳、便秘； 頭暈、眼花，嗜睡，精力不集中,體征： 皮膚黏膜蒼白； 黃疸； 肝脾腫大,貧 血,失血性貧血 缺鐵性貧血 巨幼細(xì)胞性貧血 再生障礙性貧血 溶血性貧血,溶血性貧血：各種原因使紅細(xì)胞生存時(shí)間縮短，破壞增多，骨髓

2、造血代償不足時(shí)發(fā)生的一類貧血,紅細(xì)胞破壞增加,紅細(xì)胞代償性增加,溶血：紅細(xì)胞非自然衰老而提前遭受破壞的過程。 溶血性疾病：發(fā)生溶血而骨髓能夠代償，未出現(xiàn)貧血。 溶血性貧血：溶血程度超過造血代償能力，出現(xiàn)貧血。,定義,溶血性貧血的分類 根據(jù)紅細(xì)胞破壞的場(chǎng)所：,血管內(nèi)溶血：在血流中被破壞 獲得性因素和酶缺陷 血管外溶血：在單核-巨噬系統(tǒng)中被破壞 膜缺陷、珠蛋白異常、 脾功亢進(jìn) 原位溶血： 在骨髓中被破壞 巨幼細(xì)胞貧血、急性白血病,溶血性貧血的分類 根據(jù)發(fā)生機(jī)制：,代表疾病,膜,酶,血紅蛋白,紅細(xì)胞 內(nèi)在缺陷,遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥 遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥,G6PD缺陷癥 PK缺陷癥,珠蛋白生成障

3、礙性貧血 異常血紅蛋白病,溶血性貧血的分類,紅細(xì)胞外在因素?fù)p傷,免疫因素,非免疫因素,AIHA,CAS,PCH,藥物誘發(fā)的免疫性溶貧,新生兒同種免疫性溶貧,溶血性輸血反應(yīng),PNH,微血管病性溶血性貧血,心源性溶血性貧血,行軍性血紅蛋白尿癥,砷化物、硝基苯、苯肼、蛇毒等中毒,溶血性鏈球菌、瘧原蟲、產(chǎn)氣莢膜桿菌等感染,（一）顯示紅細(xì)胞破壞增加的依據(jù) 1 紅細(xì)胞壽命縮短、破壞增加的檢驗(yàn) 紅細(xì)胞壽命測(cè)定； 紅細(xì)胞形態(tài)改變； 血漿LDH測(cè)定,2 血紅蛋白代謝的檢驗(yàn) 血漿游離血紅蛋白測(cè)定(40mg/L)； 血管內(nèi)溶血的指征 血清結(jié)合珠蛋白測(cè)定 (500-1500mg/L)； 肝臟合成的2糖蛋白，運(yùn)輸游離血

4、紅蛋白 血漿高鐵血紅素白蛋白試驗(yàn)； 不敏感，見于嚴(yán)重血管內(nèi)溶血,（二）顯示紅細(xì)胞代償增生依據(jù) 外周血網(wǎng)織紅增多； 外周血紅細(xì)胞形態(tài)： 大小不均，大紅細(xì)胞、嗜多色細(xì)胞及有核紅細(xì)胞，Howell-Jolly小體、Cabot環(huán)、點(diǎn)彩紅細(xì)胞等 增生性貧血骨髓象： 增生明顯活躍，紅系顯著增生，粒系相對(duì)減少，巨核系一般正常,（二）顯示紅細(xì)胞代償增生依據(jù) 外周血紅細(xì)胞形態(tài)： 大小不均，大紅細(xì)胞、嗜多色細(xì)胞及有核紅細(xì)胞，Howell-Jolly小體、Cabot環(huán)、點(diǎn)彩紅細(xì)胞等,Howell-Jolly小體 Cabot環(huán),特 點(diǎn),1.遺傳性溶血性貧血常有貧血、黃疸、脾腫大的家族史 2.某些溶貧呈一定的地域性分布

5、 3.化學(xué)因素所致常和患者所從事的職業(yè)有關(guān) 4.多種藥物都可致溶貧 5.長期反復(fù)貧血和黃疸見于遺傳性溶貧，自身免疫性溶血 性貧血亦常表現(xiàn)為時(shí)重時(shí)輕 6.惡性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和SLE易并發(fā)AIHA， 人工心臟瓣膜置換術(shù)后常易致繼發(fā)性紅細(xì)胞破碎綜合征,溶貧的實(shí)驗(yàn)室診斷,1.確定是否為溶血性貧血 2.確定主要的溶血部位是血管內(nèi)還是血管外 3.查找溶血原因，明確診斷,Hb代謝示意圖,珠蛋白 血紅素 鐵 +卟啉,單核巨噬系統(tǒng) 脾臟,血管外溶血,RBC,血管內(nèi)溶血,血漿游離Hb,腎臟,血紅蛋白尿,游離膽紅素,肝臟,結(jié)合珠蛋白,近曲小管上皮細(xì)胞,腎閾,結(jié)合膽紅素,糞膽原的腸肝循環(huán),含鐵血黃素尿 R

6、ous 實(shí)驗(yàn),膽汁,糞膽原,腸道,血液,腎臟,尿膽原,高鐵血紅蛋白,清蛋白/血紅素蛋白,檢查 一溶血性貧血的篩查檢測(cè) 血漿游離血紅蛋白測(cè)定 參考值 0-40 mg/L 意義：見于血管內(nèi)溶血 血清結(jié)合珠蛋白檢測(cè) 參考值 0.5-1.5g/L 意義：見于血管內(nèi)溶血及嚴(yán)重的血管外溶血,血漿高鐵血紅素清蛋白檢測(cè) 正常結(jié)果：陰性 意義：陽性見于嚴(yán)重血管內(nèi)溶血 含鐵血黃素尿試驗(yàn)（Rous試驗(yàn)） 血紅蛋白在腎小管上皮細(xì)胞代謝為 含鐵血黃素，脫落后鐵染色法查出 正常結(jié)果：陰性 意義：陽性見于慢性血管內(nèi)溶血 紅細(xì)胞壽命測(cè)定 正常紅細(xì)胞半衰期為天溶血性 貧血時(shí)常天,溶血原因分析的有關(guān)檢驗(yàn),一、紅細(xì)胞膜缺陷的檢驗(yàn)

7、二、紅細(xì)胞內(nèi)酶缺陷的檢驗(yàn) 三、珠蛋白合成異常的檢驗(yàn) 四、自身免疫性溶血的檢驗(yàn) 五、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥有關(guān)檢測(cè),一、紅細(xì)胞膜缺陷的檢測(cè),（一）紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn) （erythrocyte osmotic fragility test) 目的：了解紅細(xì)胞的滲透脆性（即抵抗力） 原理：,紅細(xì)胞皺縮,紅細(xì)胞膨脹甚至破裂,高滲溶液,等滲溶液,正常,紅細(xì)胞對(duì)低滲溶液的抵抗能力 0.6 - 0.8%NaCl溶液紅細(xì)胞不破裂 0.42-0.45%NaCl溶液部分紅細(xì)胞破裂 0.35-0.30%NaCl溶液紅細(xì)胞完全破裂,NaCl,0.6%,對(duì)低滲溶液抵抗能力減小即RBC滲透脆性增加,脆性增高：遺傳球（橢

8、）、AIHA伴球形細(xì)胞增多（在0.52或0.72開始溶)。 脆性減低: 各型地中海貧血、缺鐵性貧血、肝硬化及阻塞性黃疸等。,結(jié)果： 正常人開始溶血0.40.4%，完全溶血0.280.32% （患者與對(duì)照相差0.04%以上即為陽性）。,（二）紅細(xì)胞孵育滲透脆性試驗(yàn) （erythrocyte incubated osmotic fragility test) 原理：紅細(xì)胞在37 C孵育過程中，葡萄糖消耗增加，ATP貯備減少，鈉泵受阻，鈉離子在胞內(nèi)聚集，紅細(xì)胞膨脹破裂 參考值：未孵育 50%溶血 4.00 - 4.45 g/L NaCl溶液 37 C孵育50%溶血 4.65 -5.90 g/L Na

9、Cl溶液 臨床意義： 用于輕型遺傳性球形細(xì)胞增多癥、遺傳性非球形細(xì)胞溶貧的診斷和鑒別診斷,（三）自身溶血試驗(yàn)（及糾正試驗(yàn)） （autohemolysis and correction test),原理：先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血病人紅細(xì)胞內(nèi)酶缺陷，葡萄糖酵解障礙，生成ATP不足，不能維持鈉泵，導(dǎo)致溶血增強(qiáng)。加入葡萄糖或ATP，觀察溶血能否被糾正。,參考值：正常人紅細(xì)胞孵育48h小時(shí)后，溶血度3.5%；加入葡萄糖或ATP后明顯糾正，溶血度1%,I型：G6PD缺乏癥； II 型：丙酮酸激酶缺陷癥,自身溶血試驗(yàn)及糾正試驗(yàn)結(jié)果（溶血%）,二、紅細(xì)胞酶缺陷的檢測(cè),葡萄糖6磷酸脫氫酶缺乏癥 蠶豆?。夯颊叨?/p>

10、為兒童，在每年3-5月蠶豆成熟季節(jié)發(fā)病。起病急，在食新鮮蠶豆幾小時(shí)至幾天突然發(fā)作。表現(xiàn)為急性溶血伴有血紅蛋白尿，治療以輸血、防治急性腎功能衰竭及腎上腺皮質(zhì)激素為主。,(一) 高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn),正常時(shí)亞鐵Hb 經(jīng)亞硝酸鹽氧化成高鐵Hb，當(dāng)紅細(xì)胞內(nèi)G6-PD含量正常時(shí)，Hb Fe+ 可以還原為Fe+(紅色)；G6-PD缺乏時(shí)， Hb Fe+ 則不能還原為Fe+(褐色)，通過顏色變化來間接測(cè)知G6-PD含量是否缺乏。,目的：該試驗(yàn)用來了解G-6PD活性，是一種間接的方法。,紅細(xì)胞對(duì)Glu的代謝有2個(gè)途徑,1、無氧糖酵解(90%),2、戊糖旁路途徑(5-10%),原理：,G6PD,高鐵Hb還原酶,

11、G6P,G6-PA,NADP,NADPH,還原型美蘭,氧化型美蘭,高鐵Hb（Fe3+）為褐色,氧合HB（Fe2+）紅色,結(jié)果：光電比色法 ，正常還原率75%，低于75%為異常， 提示G6PD活力，74 31%為G-6PD缺乏的雜合子（紅棕 色），30%以下為顯著缺陷的純合子（為棕色 目測(cè)比色法）。,（二）氰化物-抗壞血酸鹽試驗(yàn) 原理: 6-磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血紅蛋白 6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高鐵血紅蛋白 結(jié)果:正常人標(biāo)本呈紅色 臨床意義: 1.純合子G6PD缺乏經(jīng)1-3h溫育后,變?yōu)樽厣?2. 雜合子標(biāo)本3-4h變成棕紅色,G-6PD,（三）變

12、性珠蛋白小體生成試驗(yàn),又稱“紅細(xì)胞包涵體”、 “赫恩小體”、 “Heinz小體”、 “海因小體” 原理：G-6PD缺乏及不穩(wěn)定Hb病患者 Hb易被氧化，其珠蛋白變性沉著于紅細(xì)胞膜上。,抗凝血 +乙酰苯肼,37溫育24h,充分的氧化,其Hb氧化成Heinz小體（用結(jié)晶紫、甲紫或煌焦油蘭染色，油鏡觀察）,1. 正常人 30% 2. G6P缺陷癥、不穩(wěn)定Hb、HbH病等常高于45%,結(jié)果： 該小體為圓形或多角形色涵體，0.22um。 多位于紅細(xì)胞邊緣，一個(gè)紅細(xì)胞含120個(gè)，多為12個(gè)，以含5個(gè)以上小體的紅細(xì)胞計(jì)數(shù),（四）G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定 原理: G6PD 使NADP還原成NADPH,

13、后者在紫外線照射下發(fā)出熒光 參考值： 正常人強(qiáng)熒光； 酶活性 5 U/gHb,三、珠蛋白合成異常的檢測(cè),血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 原卟啉 血紅素 Hb（四聚體） 鐵 2條鏈 珠蛋白：由4條多肽鏈組成 2條非鏈,正常人 HbA（22） 97% HbA2（22）1.5-3% HbF（2 2） 0.5-0.8%,血紅蛋白病 珠蛋白肽鏈量的不正常(地中海貧血) 血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)異常(異常血紅蛋白病) 遺傳性溶血性疾病,(一) 血紅蛋白電泳,蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)是由氨基酸的NH+與COO- 決定的。 等電點(diǎn)調(diào)節(jié)水溶液的pH，能使蛋白質(zhì)的NH+與COO- 數(shù)目相等呈電中性， 此時(shí)蛋白質(zhì)無電泳，在水中電解度小，并發(fā)生沉淀

14、。,電泳：一個(gè)帶電荷的離子或膠體顆粒在電場(chǎng)中可向一極移動(dòng)。,原理：在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb等電點(diǎn)，其帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)；反之向陰極移動(dòng)。 由于各種Hb珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)不同，其等電點(diǎn)不同，電泳方向和速度亦不同，故可分離出不同的區(qū)帶，對(duì)區(qū)帶進(jìn)行電泳掃描，可進(jìn)行Hb定量分析。,(+) H J K A G D E (-) 1. HbH增多是HbH病，為-地中海貧血的一種；HbA2明顯增高見于輕型地中海貧血；HbF 明顯增高見于中重型地中海貧血。 2. 正常值：醋纖法（PH8.6）HbA 96%98% ，HbA2 1.0%3.1% ， HbF2%,電 泳 結(jié) 果,CA,A2,F,

15、A,異常,正常,（二） HbF （2 2）酸洗脫試驗(yàn)： 含HbF紅細(xì)胞著色 （三）HbF定量測(cè)定（堿變性試驗(yàn)）: 2歲-成人 HbF4%為異常， 重型 地貧30-90%， 遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合癥100% （四）HbA2定量測(cè)定 診斷輕型地貧的重要依據(jù) （五）限制性內(nèi)切酶譜分析,四、自身免疫性溶血性貧血檢驗(yàn),自身免疫性溶血性貧血 （autoimmune hemolytic anemia,AIHA),1.病因：抗紅細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制尚未闡明，有以下的解釋：病毒感染可激活多克隆B細(xì)胞或化學(xué)物與紅細(xì)胞膜相結(jié)合，改變其抗原性，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生 2.分類：本病可為原發(fā)性的，也可繼發(fā)于結(jié)締組織

16、病、造血系統(tǒng)腫瘤、感染等。 按抗體反應(yīng)最適溫度分為溫抗體型和冷抗體型，后者又分為冷凝集素綜合征和陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿,（一） Coombs試驗(yàn)（抗人球蛋白試驗(yàn)）,原理：不完全抗體(IgG)，無法架接兩個(gè)鄰近的紅細(xì)胞，而只能和一個(gè)紅細(xì)胞抗原相結(jié)合。 抗人球蛋白抗體是完全抗體,可與多個(gè)不完全抗體的Fc段相結(jié)合,導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象,稱為抗人球蛋白試驗(yàn)陽性。,目的：檢查紅細(xì)胞表面的或血清中游離的不完全 抗體，用于診斷AIHA。,直接Coombs Test(+)說明病人RBC表面上包被有不完全抗體,間接Coombs Test(+)則說明病人血清中存在著不完全抗體,Coombs血清（抗人球蛋白血清）,（一

17、）直接試驗(yàn),正常人：陰性 直接反應(yīng)陽性，最常見于AIHA（其他有藥物誘發(fā)的溶貧、陣發(fā)性冷性Hb尿、新生兒同種免疫溶血病、SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性淋巴瘤等）。,目的：測(cè)定吸附于紅細(xì)胞表面的不完全抗體,方法：,結(jié)果：,（二）間接試驗(yàn),有過?？贵w時(shí)直接、間接均為陽性。 AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。冷凝集素病為IgM抗體。,目的：測(cè)定血清中游離的不完全抗體,方法：,結(jié)果：,間接陽性，見于AIHA，正常人為陰性。,病人血清,正常RBC,抗 IgG,(二)冷凝集素試驗(yàn)： 冷凝集素是一種可逆性抗體，在低溫時(shí)可與自身紅細(xì)胞、“O”型紅細(xì)胞或患者同型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，當(dāng)溫

18、度增高時(shí)，凝集塊又消失 參考值：效價(jià) 140，反應(yīng)最適溫度4C 臨床意義：陽性見于冷凝集素綜合癥,冷凝集素綜合癥 以中老年患者為多，寒冷環(huán)境有耳廓、鼻、手指發(fā)紺，但加溫后即可消失。 除貧血和黃疸外其他體征少見 實(shí)驗(yàn)室檢查： 有輕到中度貧血，反復(fù)發(fā)作有含鐵血黃素尿。冷凝集素試驗(yàn)陽性,(三)冷熱雙相溶血試驗(yàn) 陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥（PCH）患者的血清中有雙相溶血素，在0-4C時(shí)，溶血素與紅細(xì)胞結(jié)合，并吸附補(bǔ)體，但不溶血；當(dāng)升溫至30-37C則發(fā)生溶血 參考值：陰性 臨床意義： 陽性見于陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿患者,五、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿,1.病因:紅細(xì)胞膜缺陷引起的慢性血管內(nèi)溶血 睡眠時(shí)加重 發(fā)作性