1、第一節(jié) 測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法,第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素,第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論,第五節(jié) 有害微生物的控制,第六章 微生物的生長(zhǎng)及其控制 Microbial Growth and Control,第一節(jié) 測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法,一、 測(cè)生長(zhǎng)量,二、 計(jì)繁殖數(shù),1、 直接法：用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),二、 計(jì)繁殖數(shù),2、 間接法：用平板菌落進(jìn)行的活菌計(jì)數(shù),菌數(shù)/mL = cfu X 稀釋度 X 10,第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,一、 微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng),三、 微生物的連續(xù)培養(yǎng)方法,二、 微生物的典型生長(zhǎng)曲線,一、 微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng),同步生長(zhǎng) 通過(guò)

2、同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個(gè)體處于分裂步調(diào)一致的生長(zhǎng)狀態(tài)； 獲得同步生長(zhǎng)的方法 環(huán)境條件誘導(dǎo)法 機(jī)械篩選法,二、微生物的典型生長(zhǎng)曲線(growth curve),生長(zhǎng)曲線： 當(dāng)把少量純種單細(xì)胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的溫度、通氣等體積下，該群體就會(huì)由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長(zhǎng)。如果以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)就可畫(huà)出一條曲線微生物的典型生長(zhǎng)曲線。,二、微生物的典型生長(zhǎng)曲線(growth curve), 延滯期 (lag phase), 對(duì)外界不良條件例如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學(xué)藥物的反應(yīng)敏感。,指少量微生物接種到新鮮培養(yǎng)液中后，在開(kāi)始培養(yǎng)的一段

3、時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不增加的時(shí)期。, 生長(zhǎng)速率常數(shù)R等于零。, 細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)。, 細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性。, 合成代謝活躍，核糖體、酶類(lèi)和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。,影響延滯期長(zhǎng)短的因素,（1）接種齡,（2）接種量,（3）培養(yǎng)基成分, 延滯期 (lag phase),出現(xiàn)延滯期的原因？, 指數(shù)期 (exponential phase),是指在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期。, 生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，代時(shí)G最短；, 整個(gè)群體的生理特性較一致；, 酶系活躍，代謝旺盛。, 細(xì)胞各成分平衡增長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率恒定；,三個(gè)重要參數(shù),（1）繁殖代數(shù)(n)

4、,（2）生長(zhǎng)速率常數(shù)(R),（3）代時(shí)(G), 指數(shù)期 (exponential phase),G = (t2-t1) / n = (t2-t1) / 3.322(lgX2-lgX1),R = 1 /G = 3.322 (lgX2-lgX1) / (t2-t1),X2 = X1 2n 兩邊取對(duì)數(shù)： lgX2 = lgX1 + nlg2 （lg2 =0.301） n = 3.322 ( lgX2 - lgX1), 指數(shù)期 (exponential phase),影響代時(shí)長(zhǎng)短的因素,（1）菌種,（2）營(yíng)養(yǎng)成分,（3）營(yíng)養(yǎng)物濃度,（4）培養(yǎng)溫度,營(yíng)養(yǎng)物濃度對(duì)生長(zhǎng)速度和菌體產(chǎn)量的影響, 指數(shù)期 (ex

5、ponential phase), 穩(wěn)定期(stationary phase),生長(zhǎng)速率常數(shù)R=0，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等；,菌體產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，且產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗出現(xiàn)有規(guī)律的比例關(guān)系，用生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)Y表示；,Y = (X-X0) / C0-C = (X-X0) / C0,X ：穩(wěn)定期的細(xì)胞干重(g/ml培養(yǎng)液） X0 ：剛接種時(shí)的細(xì)胞干重 C0 ：限制性營(yíng)養(yǎng)物的最初濃度(g/ml) C ： 穩(wěn)定時(shí)期限制性營(yíng)養(yǎng)物的濃度,通過(guò)對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)原因的研究，促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建；,對(duì)以生產(chǎn)菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物(SCP、乳酸)等為目的的一些發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，穩(wěn)

6、定期是產(chǎn)物的最佳收獲期：,是對(duì)維生素、堿基和氨基酸等生長(zhǎng)因子進(jìn)行生物測(cè)定的最佳測(cè)定時(shí)期；,穩(wěn)定期的實(shí)踐意義,IV 衰亡期 (death phase),微生物個(gè)體死亡速度超過(guò)新生速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)； 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)畸形； 有的發(fā)生自溶； 有的合成或釋放次生代謝產(chǎn)物； 芽孢此期釋放；,三、 微生物的連續(xù)培養(yǎng)方法,穩(wěn)定期到來(lái)的主要原因？,營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡； 有害代謝產(chǎn)物的累計(jì)； 理化條件的不適宜等；,是一種根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長(zhǎng)密度，并借光電控制系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液流速，使細(xì)菌培養(yǎng)液保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法； 主要用于獲得大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物。,1. 恒濁器

7、(turbidostat),2、恒化器 (chemostat),是一種設(shè)法使培養(yǎng)液的流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率的條件下進(jìn)行繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置； 主要獲得不同生長(zhǎng)速率的菌體；,恒濁與恒化培養(yǎng)控制裝置,Turbidostat & chemostat的比較,分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)的比較,連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn) 高效 自控 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 節(jié)約動(dòng)力、人力、水和蒸汽等 缺點(diǎn) 菌種容易退化 容易污染雜菌 營(yíng)養(yǎng)物的利用率低于單批培養(yǎng),微生物的高密度培養(yǎng),指微生物在液體培養(yǎng)中細(xì)胞群體密度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上的生長(zhǎng)狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)； 目前由于研究的微生物種類(lèi)主要局限于E.coli and S.c

8、erevisiae 等兼性厭氧菌；,第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素,一、 溫度,二、 氧氣,三、 pH值,一、 溫度(temperature),嗜冷菌 (20oC) 嗜溫菌 (20-45oC) 嗜熱菌 (50-60oC) 嗜高溫菌 (80-95oC) 極端高溫菌(105-150oC),根據(jù)溫度對(duì)微生物的影響分類(lèi),Thermophile and Biotechnology,來(lái)自嗜熱菌的酶可在高溫下穩(wěn)定的催化生物化學(xué)反應(yīng)；其中由Thermus aquaticus 中分離出來(lái)的 DNA 聚合酶，Taq polymerase， 已廣泛應(yīng)用于PCR反應(yīng)； 分離自Pyrocuccus furiosus

9、的 pfu polymerase應(yīng)用于PCR反應(yīng)更加穩(wěn)定，而且錯(cuò)誤率更低；,二、 氧氣 (oxygen),微生物與氧的關(guān)系,厭氧菌的氧毒害機(jī)制,厭氧菌體內(nèi)無(wú)SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物體內(nèi)普遍存在的超氧陰離子自由基的毒害作用。,去除O2-等有害活性氧分子的機(jī)制,三、 pH值,嗜堿微生物（basophile） 多數(shù)放線菌、硝化細(xì)菌、根瘤菌等 耐堿微生物（basotolerant microorganism） 若干鏈霉菌 嗜酸微生物（acidophile） 多數(shù)真菌 耐酸微生物(acidotolerant microorganism) 乳酸桿菌、醋酸桿菌，許多腸桿菌等,第四節(jié) 微生物培養(yǎng)方

10、法概論,1、好氧菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),2、厭氧菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),高層瓊脂柱,Hungate 滾管,厭氧罐技術(shù),厭氧手套箱,第五節(jié) 有害微生物的控制,一、 幾個(gè)基本概念,1、滅菌 (sterilization),采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施。例如各種高溫滅菌措施等。,2、消毒 (disinfection),消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被消毒的物體基本無(wú)害的措施。 舉例： 一些常用的對(duì)皮膚、水果、飲用水進(jìn)行藥劑消毒的方法； 對(duì)啤酒、牛奶、果汁和醬油等進(jìn)行消毒處理的巴氏消毒法等；,3、防腐(antisepsi

11、s),防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。 防腐的常用措施 低溫 缺氧 干燥 高滲 高酸度 防腐劑,4、化學(xué)治療 (chemotherapy),它是利用具有高度選擇毒力（selective toxicity，即對(duì)病原菌具有高度毒力而對(duì)宿主無(wú)顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。 用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱(chēng)化學(xué)治療劑； 一些重要的化學(xué)治療劑種類(lèi)： 各種抗生素 磺胺類(lèi)藥物 中草藥中的有效成分等,滅菌、消毒、防腐和化療的比較,（一）物理方法高溫殺菌,烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法,150170 12h 徹底殺滅細(xì)

12、菌； 適用于金屬和玻璃器皿的滅菌；,火焰灼燒法,僅適用于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動(dòng)物尸體的燒毀等。,干熱滅菌法,1、熱蒸汽對(duì)細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)； 2、熱蒸汽比熱空氣穿透力更強(qiáng)； 3、蒸汽存在潛熱，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變成液體時(shí)可放出大量熱量； 4、可迅速提高滅菌物體的溫度。,相同溫度下，濕熱滅菌比干熱滅菌好；,濕熱滅菌法,干熱與濕熱空氣對(duì)不同細(xì)胞的致死時(shí)間,巴氏消毒法,一種低溫濕熱消毒法。,間歇滅菌法 (fractional sterilization),80100 1560 min 殺滅所有微生物的營(yíng)養(yǎng)體； 37 或室溫保溫過(guò)夜，誘發(fā)芽孢萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體； 重復(fù)上述步驟三次，在較低的滅菌溫

13、度下徹底滅菌； 適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。,高壓蒸汽滅菌法,121 ；15-20 min；1kg/cm2 是被廣泛使用的方法；,高壓蒸汽滅菌鍋構(gòu)造,1、壓力表 2、安全閥 3、放氣閥 4、軟管 5、緊固螺栓 6、滅菌桶 7、篩架 8、水,手提式高壓蒸汽滅菌鍋,1、加水至止水線； 2、滅菌物品包裹好； 3、開(kāi)啟放氣閥； 4、加熱排氣； 5、達(dá)到預(yù)定表壓，開(kāi)始計(jì)時(shí)； 6、關(guān)閉熱源，當(dāng)壓力降至0.05MPa時(shí)，緩慢開(kāi)啟放氣閥。,高壓蒸汽滅菌鍋使用方法,4、過(guò)濾,2、輻射：紫外線、電離輻射和強(qiáng)可見(jiàn)光等,3、干燥和滲透壓（高滲）,其他物理控制方法,過(guò)濾除菌,（二） 化學(xué)方法殺菌,1. 表面消毒劑(sur

14、face disinfactant),是指對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)治療用的化學(xué)藥劑。,常用表面消毒劑及應(yīng)用,影響消毒劑作用的因素,是指那些能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇性毒性的化學(xué)藥劑； 根據(jù)來(lái)源分為兩類(lèi)： 人工合成(主要是一些生長(zhǎng)因子類(lèi)似物) 磺胺類(lèi)藥物； 微生物產(chǎn)生 抗生素,2、 化學(xué)治療劑 (chemotherapeutant),（1）磺胺類(lèi)藥物 生長(zhǎng)因子類(lèi)似物,是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子類(lèi)似物藥物； 也是人類(lèi)第一個(gè)成功地用于特異性抑制某種微生物的生長(zhǎng)來(lái)治療疾病的化學(xué)治療劑。,對(duì)氨基苯甲酸（PABA） (正常代謝物）,磺胺 (代謝物拮抗物）,磺胺類(lèi)藥物的殺菌機(jī)制P

15、ABA代謝類(lèi)似物,二氫葉酸,二氫葉酸合成酶,二氫葉酸還原酶,四氫葉酸,輔酶F,核酸合成,細(xì)菌體內(nèi)合成葉酸,二氫蝶啶,二氫蝶酸,二氫蝶酸合成酶,二氫葉酸,二氫葉酸合成酶,二氫葉酸還原酶,四氫葉酸,輔酶F,核酸合成,磺胺藥,TMP,TMP(三甲基芐二氨嘧啶) 磺胺增效劑,細(xì)菌體內(nèi)葉酸合成受阻,二氫蝶啶,二氫蝶酸,二氫蝶酸合成酶,PABA,假二氫葉酸,（2）抗生素 (antibiotics),一類(lèi)由微生物或其他生物生命活動(dòng)過(guò)程中合成的次生代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們?cè)诤艿蜐舛葧r(shí)就能抑制或干擾他種生物（包括病原菌、病毒和癌細(xì)胞等)的生命活動(dòng)，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑； 目前在臨床上應(yīng)用的抗生素僅五六

16、十種。,抗生素的抗菌譜,由于不同微生物對(duì)不同抗生素的敏感性不一樣，抗生素的作用對(duì)象就有一定的范圍，這種作用范圍成為抗生素的抗菌譜。,抗生素的作用機(jī)制,抑制細(xì)胞壁合成； 干擾細(xì)胞膜的功能； 抑制蛋白質(zhì)的合成； 抑制核酸的合成；,1.抑制細(xì)胞壁合成,TMP,磺胺藥,PAPB,細(xì)胞膜,多粘菌素 短桿菌肽,鏈霉素 卡那霉素 四環(huán)素,3.抑制蛋白質(zhì)合成,紅霉素 氯霉素,2. 抑制RNA合成,2.抑制DNA解旋酶,諾氟沙星 新生霉素,主要抗生素和化學(xué)治療劑的作用模型,利福霉素 利福平,3.抑制蛋白質(zhì)合成,4. 干擾細(xì)胞膜合成,5.抑制細(xì)胞代謝,微生物的抗藥性,抗藥性主要通過(guò)遺傳途徑產(chǎn)生，如基因突變、遺傳重

17、組或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等。,1、產(chǎn)生一種能使藥物失去活性的酶； 2、把藥物作用的靶位加以修飾； 3、形成“救護(hù)途徑”； 4、使藥物不能透過(guò)細(xì)胞膜； 5、通過(guò)主動(dòng)外排系統(tǒng)把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外。,微生物產(chǎn)生抗藥性的原因,如何解決微生物的抗藥性問(wèn)題？,篩選新的抗生素； 對(duì)天然抗生素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造； 尋找比抗生素療效更為廣泛的生理活性產(chǎn)物； 生物藥物素：具有多種生理活性的微生物次生代謝物； 酶抑制劑 免疫調(diào)節(jié)劑 受體拮抗劑 抗氧化劑,解決方法,在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，如果要縮短其生長(zhǎng)的延遲期，可以在菌種、培養(yǎng)基和其它方面采取哪些措施? 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線分哪幾個(gè)時(shí)期？各時(shí)期有何特征及在工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用。 單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)規(guī)律常分為哪四個(gè)時(shí)期？各有何特點(diǎn)？ 辨析題：分批培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌首先經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)期，此期間細(xì)胞處于代謝活動(dòng)的低潮，所以細(xì)胞數(shù)目并不增加。,思考題,在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，引起pH改變的原因有哪些？在