1、ELISA實驗、酶標(biāo)儀、洗板機的原理和使用,1,酶標(biāo)（ELISA）,ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。 以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù) 自上世紀(jì)70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。,2,1.ELISA的原理 2.ELISA的類型 3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑 結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備 4.對照設(shè)定 5.標(biāo)本的采取和保存 6.結(jié)果判斷,3,ELISA是一種免疫測定。 基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)

2、記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。,1.ELISA的原理,4,ELISA技術(shù)原理,1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 2. 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性。 3. 酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。 4. 受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。 5. 此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。 6. 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺

3、進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。,5,1.1抗原抗體反應(yīng),1.1.1可逆性,抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為： Ag+AbAgAb,抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。,6,1.1.2特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，

4、而不需先分離待檢物。,7,1.1.3最適比例,8,1.1.4敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平 酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。,9,2ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑： （1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。,10,雙抗體

5、夾心法測抗原,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。,樣品（抗原）,酶標(biāo)抗體,底物,酶標(biāo)儀測定OD值,終止液,11,雙抗原夾心法測抗體,用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,12,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或

6、抗體的固相載體（免疫吸附劑）；A （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； B （3）酶的底物； C （4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液,13,3.1 ELISA的試劑準(zhǔn)備 A,固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。 良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不

7、相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。 洗滌液：在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。,14,3.2 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B,結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑 1. 酶的催化活性 2. 抗體（或抗原）的免疫活性 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。,15,酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。

8、酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 在ELISA中，HRP（辣根過氧化物酶），AP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,16,3.3

9、試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物,E,3.3.1 HRP的底物,HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。,17,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。,3.3.2 AP的底物,3.3.3 酶反應(yīng)終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,18,3.4 對照設(shè)定,

10、陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。,19,參考標(biāo)準(zhǔn)品,定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中.,陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HB

11、s也是陰性。,20,酶標(biāo)基本步驟,用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1

12、ml 371030分鐘。 5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELX808酶標(biāo)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。,21,22,加樣,在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。,基本操作注意事項：,基本

13、操作： 加樣； 溫育； 洗滌； 讀板；,23,溫育,抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。,24,洗滌,洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。 目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) 洗滌步驟： 1. 吸干孔內(nèi)反應(yīng)液； 2. 將洗滌液注滿板孔； 3. 放置2min，略作搖動； 4. 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為34次，有時甚至需洗56次。,25

14、,洗板機,手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費時間，目前市面上多種洗板機可供選擇，其中以美國寶特的BIO-TEK ELX50 洗板機最為突出 洗板機優(yōu)勢： 自動化控制 精確度高 速度快（最快小于20S每板/每循環(huán)）,細(xì)胞包被層,ELx50洗滌 速度可調(diào)、角度最佳,手工洗滌或一般機器洗滌 角度不好，速度太快,26,洗板機使用注意事項,1、有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效果，一般不超過6次。 2、注意每孔的加液量：以加滿為宜，但不可溢出，一般為每控300微升。 3、建議在洗滌前進行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，以降低殘留量。因為一般ELISA實驗洗滌結(jié)束后要求扣板，但此步驟在PCR-ELI

15、SA中易造成污染，故殘留量應(yīng)盡量減少。不能象一般ELISA操作一樣用力扣板。 4、建議用戶采用兩點吸液與底部沖洗方式，以得到好的洗滌效果。 5、如果作PCR-ELISA液罐應(yīng)加有1%次氯酸鈉，加入的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。每天使用完畢后應(yīng)用1%次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。 6、定期維護、檢修儀器及配件。,27,洗板機的應(yīng)用范圍,所有涉及到96孔板換液、孵育、洗滌的實驗： ELISA 熒光ELISA 細(xì)胞洗滌 In Cell Western ,28,顯色,顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。 反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性

16、孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。,比色/讀板,將96孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。 結(jié)果以光密度（oplical density，OD/吸光度（absorbence，A）表示，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,29,酶標(biāo)儀,酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀E

17、LISA光度計。,美國寶特BioTek ELX800 全自動酶標(biāo)儀,鍵盤格式,30,酶標(biāo)儀的檢測原理,酶標(biāo)儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。 檢測單位： 光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。 檢測單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD1og（1trans），其中trans為檢測物的透光值。 在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測定

18、檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。,31,酶標(biāo)儀配件,光源： 氙閃燈（波譜寬、低熱輻射、壽命長，但是可見區(qū)能量低） 鹵素?zé)簦ú荒苡糜谧贤鈪^(qū)，可見區(qū)能量強）,ELx800光源： 鹵鎢燈光源,32,酶標(biāo)儀配件,濾光片和單色器： 濾光片和單色器各有優(yōu)缺點，選擇濾光片還是單色器和具體的實驗要求有關(guān)。 光吸收ELISA： 單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴姶?，兩者的靈敏度不相上下，單色器更為靈活、方便使用。 熒光檢測ELISA 各有優(yōu)缺點，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特異性好、靈敏度高，但靈活性不足。一般ELISA都是使用常用的熒光素，對科研工作者來講濾光片較好。,ELx800 標(biāo)配濾光片405, 450, 490, 630 nm 連續(xù)波長(采用單色器),33,MD 公司：業(yè)界老大，產(chǎn)品質(zhì)量過硬，做工精細(xì)。但對中國支持服務(wù)較差、管理混亂。 BioTek 公司：與MD公司伯仲之間，產(chǎn)品質(zhì)量過硬，做工精細(xì)。進入中國市場十多年，市場占有率高，服務(wù)較好。 PE公司：著名的分析儀器生產(chǎn)商，但酶標(biāo)產(chǎn)品單一、簡單，后續(xù)支持不足。 Tecan 公司: 著名的液體分裝設(shè)備生產(chǎn)商，高端產(chǎn)品較好，底端產(chǎn)品較差。,酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家,34,Bio-tek ELx800 酶標(biāo)儀的使用,1、先從試劑說明書上獲得以下信息： （1