1、抗體工程制藥,一.概述,抗體(工程)制藥生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的重要組成部分,免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),抗體：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有 免疫功能的球蛋白。,抗體的產(chǎn)生過(guò)程： 機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被激活，增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。,免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范圍從150,000到950,000道爾頓。分五類： IgG在血清中含量最高，達(dá)7580%,是抗感染 的主要抗體; IgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為 五聚體,是對(duì)一個(gè)抗原作出反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的 第一個(gè)抗體； IgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參 與局部的免疫反應(yīng); IgD在血清

2、中含量很低; IgE在血清含量最少。,免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,動(dòng)物血清中產(chǎn)生抗體的時(shí)間示意圖,抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后， Ig將取代IgM,抗體研究的發(fā)展階段： 以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表,用抗原免疫動(dòng)物來(lái)獲得多克隆抗體。 以1975年Milstein 2.免疫動(dòng)物 小鼠(Balb/C,鼠齡6-8周)或 大鼠 (Lou);,3.常用的骨髓瘤細(xì)胞系 SP2/0，P3.653細(xì) 胞，都是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)的缺乏株。 4.免疫方法: 體外免疫法；體內(nèi)免疫法,體內(nèi)免疫法 - 顆粒性抗原(如細(xì)菌、細(xì)胞)的免疫

3、原性強(qiáng),可不加佐劑,可溶性抗原則按每只小鼠10-100ug抗原與弗氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi). 弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant,FCA）: 由礦物油（如降脂烷或液體石蠟等）、乳化劑和滅活的分枝桿菌組成的乳化佐劑。 弗氏不完全佐劑不含分枝桿菌,免疫佐劑（adjuvant ) （1）定義：先于抗原或同時(shí)與抗原混合注射機(jī)體 可增強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。 （2）應(yīng)用 弱免疫原性物質(zhì)； 免疫原劑量不足。 （3）佐劑種類 1)油性乳劑弗氏佐劑（Freund adjuvant） 2)無(wú)機(jī)化合物 3)微生物及其產(chǎn)物 4)脂質(zhì)體 5)細(xì)胞因子,二.細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇

4、性培養(yǎng) 1.細(xì)胞融合的基本方法(PEG促融) 脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞(“永久”細(xì)胞) (1108) (23107) 聚乙二醇(PEG) 37-40 2mins 融合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞） 用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇(PEG)一般選用MW4000，常用濃度為50，pH8.0pH8.2 。可加入二甲基亞砜(DMSO)。,2002年12月神舟4號(hào)飛船搭載B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞升空進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),原理： 細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí)，培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞，還有大量未融合的雙親細(xì)胞。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求

5、和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。,2、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基。 次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻斷DNA合成)、 胸腺嘧啶(T)。 脾細(xì)胞具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),因此脾-瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶,用次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA,使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。,HAT選擇培養(yǎng)機(jī)制,主要途徑 糖 氨基酸 氨甲喋呤（A） 次黃嘌呤(H) GMP 核苷酸 DNA HGPRT 核苷酸前體 TK(胸苷激酶) 胸腺嘧啶核苷(T) dTMP,HAT培養(yǎng)基： H 為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核

6、苷酸旁路合成原料） A 可阻斷正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T 在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料,含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24/96孔板內(nèi)懸浮培養(yǎng)，23天換液一次(HAT的培養(yǎng)液7天內(nèi)),第714天改用HT培養(yǎng)液（對(duì)照阻的骨髓瘤細(xì)胞已死亡）14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。 89天可對(duì)所有克隆生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè),篩選出產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆.,培 養(yǎng) 板,B細(xì)胞雜交瘤的技術(shù)流程,三.篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 1.篩選方法： 免疫酶技術(shù) 放射免疫技術(shù) 免疫熒光技術(shù),（1）免疫酶技術(shù),原理：

7、將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無(wú)色的還原型變?yōu)橛猩难趸停瑥亩砻髂撤N抗原或抗體的存在。,（2）免疫熒光技術(shù),原理： 將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體（或抗原）結(jié)合，然后將熒光素標(biāo)記的抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定抗原或抗體。 免疫熒光技術(shù)用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè),特別是檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本。,（3）放射免疫技術(shù),原理：將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相

8、結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。 放射免疫測(cè)定原理示意圖,2.克隆化 為提高篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆的穩(wěn)定性，將單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。 有限稀釋法：通過(guò)一系列稀釋，使每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔平均只含一個(gè)細(xì)胞，而分離細(xì)胞 軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞懸液分散在半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖上，使呈單個(gè)細(xì)胞定位生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到克隆化的目的。,四.雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 1. 雜交瘤細(xì)胞借助染色體分析鑒定 多數(shù)為端著絲粒染色體,染色體數(shù)目 接近兩種親本細(xì)胞染色體之和。 2. 抗體鑒定 Ig類和亞類鑒定：免疫擴(kuò)散或 ELISA法 親和力鑒定,抗體類別鑒定（Ig類和亞類鑒定） 抗體分子因有

9、大小、帶電量、溶解度及其與抗原的作用不同，可分為不同的類和亞類。 IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4） IgA（IgA1、IgA2） IgM（無(wú)） IgD （無(wú)） IgE （無(wú)）,1）免疫擴(kuò)散,指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在液相中特異結(jié)合后，形成的免疫復(fù)合物受電解質(zhì)影響出現(xiàn)的沉淀線現(xiàn)象。 單向免疫擴(kuò)散 雙向免疫擴(kuò)散,（2）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),原理：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，再將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大

10、小進(jìn)行定性或定量分析的方法。,ELISA,ELISA,五.單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn) 單克隆抗體的生產(chǎn)包括細(xì)胞培養(yǎng)、提純和制劑等工藝過(guò)程。 1.雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) 生物反應(yīng)器：氣升式發(fā)酵罐，中空纖維培養(yǎng) 罐，微囊發(fā)酵罐 培養(yǎng)基：牛淋巴液，血清,2.單克隆抗體的大量制備的方法 體外培養(yǎng)法 (收獲10-400ug/ml抗體) 酶標(biāo)板上培養(yǎng) 微載體懸浮培養(yǎng)（固體顆粒用DEAE-Sephadex A50等材料）。 動(dòng)物體內(nèi)誘生法 用0.5ml降脂烷/液體石蠟注入腹腔,然后注射1106雜交瘤細(xì)胞，再 收獲52Omg/ml抗體。,支原體污染！,3.單克隆抗體(McAb)的純化,純化單克隆抗體流程(大鼠),

11、單抗純化方法: 超濾法 鹽析法 離子交換法 凝膠過(guò)濾法 HPLC法等,三.單克隆抗體藥物的現(xiàn)狀,250多種抗體類藥物在臨床試驗(yàn)中 1/3已進(jìn)入三期臨床 1/4已通過(guò)臨床III期試驗(yàn) 美國(guó)市場(chǎng)上有13種治療用的抗體藥物 抗體藥物的銷售額 97-99年由4.68億美元增長(zhǎng)到13億美元 03年抗體類藥物總銷售額達(dá)到50億美元,抗體藥物市場(chǎng)銷售額,2011,全球有超過(guò)200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體 正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（38家）：,Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biog

12、en BioTransplant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson 在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí)，可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中; 如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。,單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式: 一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%，但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性; 二是分泌型表達(dá)，將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗

13、體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量?jī)H在數(shù)毫克左右。,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小識(shí)別單位,CDR,4 雙特異抗體和多價(jià)抗體,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年提出。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific anti

14、body,BSAb)是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。1種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。 即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。,抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,稱之為抗體融合蛋白。 根據(jù)構(gòu)建方式，抗體融合蛋白主要分兩種形式： Fc融合蛋白（Fc fusion protein,FcFP） 抗原結(jié)合融合蛋白（antigen-Binding fusion protein,ABFP）,抗體融合蛋白,Fc融合蛋白 由抗體的Fc 段與某些具

15、有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素（immunoadhesin）就是由抗體的Fc段與2個(gè)CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成。 抗原結(jié)合融合蛋白 由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。,抗體融合蛋白,一、免疫粘附素 定義 將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N-端連接于人細(xì)胞表面的受體分子或細(xì)胞粘附分子上，在真核細(xì)胞中表達(dá)出正確折疊的融合抗體蛋白分子，這種分子可同時(shí)發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能及其它相應(yīng)的效應(yīng)功能，這種分子被稱為免疫粘附素(immunoadhension)或新效能抗體。,二、免疫毒素 免疫毒素又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性

16、的載體分子與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。,三、催化抗體 天然抗體體現(xiàn)的是結(jié)合活性，而酶發(fā)揮的是催化活性。如何把這兩者的特點(diǎn)集為一體，從而使抗體也能成為具有催化活性的物質(zhì)，同時(shí)也能使酶與有關(guān)的抗原結(jié)合。即催化抗體(catalytic antibody)催化抗體的構(gòu)建主要是把具有催化作用的基團(tuán)與抗體分子進(jìn)行重組。,噬菌體抗體,噬菌體抗體庫(kù)(phage antibody library)技術(shù)定義： 通過(guò)PCR將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來(lái)，并在噬菌體表面表達(dá)、分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。,噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)的要點(diǎn):,外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端

17、,將基因組合文庫(kù)插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫(kù),從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù)。,使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過(guò)純化即可獲得目的抗體。,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，,該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來(lái); 可繞過(guò)雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù); 抗體基因篩選的范圍廣; 技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn); 適用范圍廣，

18、既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。 不經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合及動(dòng)物免疫等步驟,噬菌體抗體庫(kù)的分類 （一）按抗體基因的性質(zhì)分 1. DNA文庫(kù) 2. cDNA文庫(kù) （二）按抗體基因的來(lái)源分 1天然抗體庫(kù)(native antibody library) 2免疫抗體庫(kù) 3半合成抗體庫(kù) 4全合成抗體庫(kù),用SCID小鼠制備人單抗,SCID小鼠,移植入人淋巴細(xì)胞 （人鼠嵌合模型）,抗原免疫,雜交瘤技術(shù),基因工程,人單抗,人抗體鼠將小鼠Ig基因滅活，然后轉(zhuǎn)入人Ig基因，生產(chǎn)出人單抗,遺傳工程鼠,基因工程抗體真核細(xì)胞高效表達(dá)流程圖,單抗研發(fā)的演變歷程,鼠單抗 100% 鼠源 OKT

19、-3 Panorex Zevalin,鼠/人崁合單抗 (66-75 % 人源) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect,人源化單抗 (90-95 % 人源) Zenapax, Mylotarg, Herceptin, Campath Synagis,100% 人源,抗體在體外人源化存在的問(wèn)題,操作過(guò)程復(fù)雜 需付出昂貴的代價(jià) 抗體的親和力降低 抗體不是人體免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生 異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合,最理想的單克隆抗體,100%人源 人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生,全人抗體的理論基礎(chǔ),癌癥細(xì)胞、病毒、細(xì)菌對(duì)人機(jī)體而言均為異己物 人體不斷受異己物攻擊，但免疫系統(tǒng)通常有清除能力 免疫

20、系統(tǒng)通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)異己物做出反應(yīng) 體液免疫就是針對(duì)異己物天然地產(chǎn)生抗體,全人抗體面臨的關(guān)鍵問(wèn)題,持續(xù)分泌抗體的人 B細(xì)胞 抗體分泌細(xì)胞的保持,30年來(lái)的全人抗體的嘗試,鼠骨髓瘤不適合與人B細(xì)胞融合 -穩(wěn)定性差 -抗體產(chǎn)量低 非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒 (EBV) 保存抗體分泌細(xì)胞 -細(xì)胞株不穩(wěn)定 -抗體的產(chǎn)量低 -不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞 很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株,全人抗體技術(shù)的最新突破,成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體的研究進(jìn)入新的里程 用途：能穩(wěn)定的保持人B細(xì)胞分泌抗體的能力 發(fā)明人：英國(guó)劍橋大學(xué)的Dr.Karpas教授 意義： 1 在整體水平上研究人類產(chǎn)生的抗體 2 開創(chuàng)人類抗體基

21、因組學(xué)的研究 評(píng)價(jià)： 諾貝爾獎(jiǎng)得主Dr.Milstein 推薦發(fā)表 在PNAS，世界權(quán)威雜志“科學(xué)”發(fā)表了 新聞評(píng)述，劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會(huì),人人雜交瘤技術(shù),開發(fā)針對(duì)未知抗原的全人治療用抗體的唯一技術(shù) 分離、保存穩(wěn)定分泌天然抗體的B細(xì)胞先進(jìn)方法。 尋找新型腫瘤相關(guān)抗原的捷徑,人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì),（1）迅速高效的生產(chǎn)天然人類單克隆抗體 抗原選定和抗體產(chǎn)生都由人類免疫系統(tǒng)完成， 不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)，與人體免疫系統(tǒng)配合良好 能獲得最佳親和力和中和活性的抗體 更合理的自然選擇藥物設(shè)計(jì)方式 加速抗原的發(fā)現(xiàn)和抗體的開發(fā)過(guò)程,人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì),（2）簡(jiǎn)便、低費(fèi)用的抗原抗體研究生產(chǎn)方式 與其他抗體改良技術(shù)相比操作更簡(jiǎn)便 起始抗體分泌水平較高，可直接用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn) 避免了改良技術(shù)引起的抗體失活 無(wú)需發(fā)現(xiàn)抗原和對(duì)抗原進(jìn)行功能確定,人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì),（3）唯一研究全人抗體圖譜的技術(shù)。 確定人類免疫識(shí)別系統(tǒng)，確定人類免疫系統(tǒng)在不同的生理、病理以及發(fā)育條件下得到的抗體圖譜。 （4）研究癌癥免疫學(xué)和抗原基因組的最新技術(shù)。 尋找人類癌癥抗原，將找到的抗原作為癌癥疫苗和抗體藥物開發(fā)的靶標(biāo)。,人人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì),