1、實(shí)驗(yàn)一、真核生物基因組DNA的提取、電泳,掌握Southern blot的原理及基本步驟 掌握人外周血基因組模板DNA的提取技術(shù)。 學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和技術(shù) 。,第一部分 ：裂解紅細(xì)胞、蛋白酶k消化 第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀基因組DNA 第三部分： 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳 第四部分： 基因組DNA變性，中和及轉(zhuǎn)膜,二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,三、主要試劑（稍后講解）,一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?四、實(shí)驗(yàn)步驟（馬上講解）,1）取0.3ml抗凝血置于1.5ml Eppendorf管中. 2）加入1ml STMT 溶液，充分混勻，靜置5min，使其溶血。 3）9,000rpm,離心 3 分鐘(統(tǒng)一離心

2、)。 4） 棄上清。彈管底重懸沉淀。,實(shí)驗(yàn)第一部分 裂解紅細(xì)胞、蛋白酶K消化,注意事項(xiàng)： 離心時(shí)離心機(jī)內(nèi)樣品平衡后對(duì)稱放置 加樣器加樣準(zhǔn)確。,4）加 0.4ml生理鹽水，懸浮細(xì)胞。 5） 9000rpm,離心 3分鐘(統(tǒng)一離心)，棄上清，彈勻。,6）加460 l NE溶液，混勻。 7）加30 l 10%SDS, 迅速混勻。 8）加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混勻， 置50C水浴1小時(shí)。,操作注意事項(xiàng)： 1、混勻時(shí)確認(rèn)沉淀已被懸起。 2、注意30ul、50ul加樣體積準(zhǔn)確。,實(shí)驗(yàn)第一部分 裂解紅細(xì)胞、蛋白酶K消化,核酸提取的主要步驟,課間介紹,真核細(xì)胞基因組在提取過程中一般有以下幾步:

3、 1) 破碎細(xì)胞 2) 去除蛋白質(zhì)，糖類等等生物大分子；由于真核細(xì)胞基因組較大，在純化出的DNA的操作中應(yīng)注意動(dòng)作輕柔，且在低溫下進(jìn)行，以最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切，從而獲得相對(duì)完整的DNA 3) 沉淀核酸,乙醇沉淀,SDS裂解 蛋白酶K消化,瓊脂糖電泳,PCR,DNA提取步驟圖解,酚氯仿抽提,二、各種試劑的作用,成分：S: Sugar 8% T: Triton X-100 1% M: MgCl2 0.5mM T: Tris-HCl 10mM (PH:8.0) 作用： 用Triton 細(xì)胞膜上打孔，裂解細(xì)胞。 從末梢血中提取DNA主要是從白細(xì)胞中提取。 （而紅細(xì)胞經(jīng)過溶血處理后

4、都已經(jīng)裂解）。,1、STMT 溶液：,作用：a.陰離子型去污劑，溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分 b.使蛋白質(zhì)變性 c.將細(xì)胞膜、核膜破壞；對(duì)核酸酶有抑制作用,成分：N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用：金屬離子螯合劑，抑制DNase的活性 (螯合DNase發(fā)揮活性所需的2價(jià)陽離子)。,二、各種試劑的作用,2、NE 溶液：,3、SDS ：十二烷基硫酸鈉 終濃度0.5%,4、蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶),作用：廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質(zhì)，將DNA游離。,重蒸酚: 酚的作用是變性蛋白質(zhì)，而對(duì)DNA結(jié)構(gòu)沒有影響。 無色 酚的

5、氧化產(chǎn)物(如醌等,粉紅色) 破壞磷酸二脂鍵。 重蒸酚是將酚中的酚的氧化產(chǎn)物去除。 TE溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略堿的pH值，保證DNA溶于水相。 在酸性條件下，DNA分配于有機(jī)相。 8-羥基喹啉： 0.1% 黃色酚相指示劑 抗氧化劑,作用： 去除蛋白等雜質(zhì)。酚對(duì)蛋白有強(qiáng)烈的變性作用，可使樣品中的蛋白質(zhì)變性，通過離心去除。為防止其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，一般再用氯仿抽提去除殘留的酚。,5、TE飽和重蒸苯酚：,成分：,氯仿作用： a. 氯仿的變性作用不如酚好， 但與酚共同/交替使用可增強(qiáng)去蛋白效果； b. 氯仿有加速有

6、機(jī)相和水相的分離、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；,6、酚/氯仿,7、氯仿/異戊醇 ( 24 : 1),氯仿的作用： 去除DNA水溶液中殘留的微量酚。 異戊醇的作用：減少操作過程中氣泡的產(chǎn)生。,在單價(jià)陽離子存在的情況下，乙醇可以使DNA發(fā)生沉淀。,9、無水乙醇 ：,作用：提供單價(jià)陽離子。,8、醋酸鈉：3M NaAc pH: 5.2,核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，能與很多陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)被變性。 最常用沉淀劑為1價(jià)鈉、鉀、胺和鋰等離子的鹽類，如醋酸鈉、NaCl、氯化鋰、氯化鉀等 常用有機(jī)沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇、精胺等,1、加入580ul(

7、等體積)TE飽和酚, 混勻1min. 10000rpm,2min。 (注意抽取下層酚相; 輕柔混勻，避免DNA鏈斷裂;),實(shí)驗(yàn)第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀,5、加入2-2.5倍體積無水乙醇（約1ml）混勻后置-70 沉淀10min。,4、加入1/10體積（約30ul）醋酸鈉于上清中充分混勻。,3、 將上層水相移至一新管中。加入500ul(等體積)氯仿-異戊醇，同上條件離心、取上清。,2、將上層水相移至一新管中，加入500ul(等體積)酚/氯仿， 同上條件混勻、離心。(注意要盡量抽盡，又不可吸起酚相)。,注意事項(xiàng)： 1） 本實(shí)驗(yàn)將用到的TE飽和重蒸苯酚、氯仿/異戊醇是有機(jī)試劑，比水的比重

8、大，而DNA溶解在水里，我們總是取上清。 ； 2） 在抽取完苯酚、氯仿等有機(jī)試劑，不能將加樣器平放或倒置，以防液體導(dǎo)流損壞加樣器，加完樣后立即棄掉加樣器頭。 。 3）基因組DNA由于太大，非常容易受機(jī)械剪切而斷裂，因此，為了得到完整的基因組DNA，盡量不要多次進(jìn)行物理性操作。,一定要充分 溶解沉淀,7、加入10 l雙蒸水，溶解沉淀，進(jìn)行酶切電泳。,6、10,000 r/min離心5min， 吸棄上清、濾紙條吸干內(nèi)壁液體(勿觸及DNA沉淀)， 37孵箱干燥至沉淀變透明。,藍(lán)頭,黃頭,濾紙條,(吸干內(nèi)壁液體),觀察DNA沉淀的顏色。,實(shí)驗(yàn)第三部分、基因組DNA的酶切,基因組DNA的酶切： 基因組D

9、NA 8 ul 10 x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入) 0.6 ul 置 37 保溫 45 min。,酶切相關(guān)知識(shí),1、酶活性單位 Unit （U）： 1U: 是指在1小時(shí)內(nèi)，適當(dāng)溫度下(37C)，在50ul 反應(yīng)體系中，將1ug of lambda DNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。 2、酶切體系： 10反應(yīng)緩沖液：提供內(nèi)切酶反應(yīng)最適 pH值及所需離子。 雙蒸水：無細(xì)菌和其他酶類污染。 BSA ：100-200ug/ml，保護(hù)酶蛋白不失活。 內(nèi)切酶：含50%甘油，-20保存。 反應(yīng)體積：一般根據(jù)底物DNA的量來計(jì)算。反應(yīng)體系中甘油濃度應(yīng)5%。,1. Southe

10、rn blot DNA水平基因結(jié)構(gòu)分析的重要策略之一. 基因組DNA酶切電泳后可以直接用于Southern blot 轉(zhuǎn)膜。 2.構(gòu)建基因組文庫 3.PCR的模板 克隆表達(dá)基因 分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化 基因組PCR產(chǎn)物的酶切電泳可以分析基因多態(tài)性； 利用內(nèi)參法可以相對(duì)定量分析特定基因在基因組上的拷貝數(shù)。,提取模板DNA的常見目的,實(shí)驗(yàn)第四部分、基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定,一、瓊脂糖凝膠電泳原理,DNA分子在 pH 8.0 的電泳環(huán)境中，帶負(fù)電荷，在一定強(qiáng)度電場(chǎng)力的作用下，從負(fù)極向正極遷移。 電泳樣品載體瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，煮沸冷卻后形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)，電泳中起分子篩作用。通常情況下，分

11、子量大的DNA電泳過程中由于受到的阻力較大，泳動(dòng)速率較慢，反之，分子量較小的DNA片段跑在前面。,二、 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作,制備瓊脂糖凝膠電泳（1%） 實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備,2. 上樣： 在樣品中加 23ul 6上樣液，混勻，將樣品緩慢加入上樣孔內(nèi),三、瓊脂糖凝膠電泳常用試劑,上樣液成份： 10.25%溴酚藍(lán)或/和0.25%二甲苯青（樣品指示劑） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加樣品比重利于加樣） 電泳緩沖液： TAE 為例 T: Tris堿 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定緩沖能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 溴化乙錠（EB）：染色劑 一種熒光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的堿基之間。在紫外光激發(fā)下能發(fā)出紅色的熒光。,致癌劑,線性DNA片斷大小（kb） 瓊脂糖濃度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,思考： 凝膠的濃度不合適時(shí)電泳會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？,四、 瓊脂糖凝膠的濃度,五、 電泳儀的使用方法,穩(wěn)壓: 電流旋鈕調(diào)到最大，再根據(jù)需要調(diào)節(jié)電壓。 如箭頭所示。,六、預(yù)期結(jié)果,用內(nèi)切酶酶切基因組，電泳結(jié)果可出現(xiàn)連續(xù)的、彌漫云霧狀帶，稱 Smear 帶。 識(shí)別 6bp序列的內(nèi)切酶，平均每4096