1、實(shí)驗(yàn)五 堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定,一、目的要求,1.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法 2.學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速度（Vm）的測(cè)定原理和方法，測(cè)出堿性磷酸酶在以對(duì)硝基苯酚磷酸為底物時(shí)的Km 和Vm值。,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析 1原理,2主要方法： （1）比較吸收光譜曲線 （2）比較最大吸收波長(zhǎng) 蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸,（3）比較吸光度的比值 純DNA,（二）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析 1原理 Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I

2、0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度； K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度,2常用方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 OD或 濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。,（2）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測(cè)定AS、AX，可求得CX。 （3）摩爾吸光系數(shù)法 C=A/（為L(zhǎng)=1cm，C為1 mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。,(三)米氏常數(shù)的測(cè)定原理,酶促反應(yīng)v-S曲線 v S 推導(dǎo)出米氏方程為： 其中S為底物濃度；v為初速度；Vm為最大反應(yīng)速度；Km 為米氏常數(shù),米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，它

3、包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同底物時(shí)，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力的強(qiáng)弱。 測(cè)定Km和Vm，可通過(guò)作圖法求得。 最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。這個(gè)方法是將米氏方程轉(zhuǎn)化為倒數(shù)形式，即： 以1/v對(duì)1/S作圖，可得一條直線,1/v 1/Vm -1/Km 1/S 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定堿性磷酸酶催化對(duì)硝基苯磷酸鈉鹽(pNPP)水解的Km和Vm. 反應(yīng)式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 無(wú)色 黃色 可通過(guò)分光光度法測(cè)定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。,三、試劑與器材 試劑： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNP

4、P、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸鈉碳酸氫鈉 pH 10.1緩沖液、0.1 mol/L NaOH、6 mg/mL堿性磷酸酶酶液 器材：恒溫水浴鍋、722分光光度計(jì),四、分光光度計(jì)的使用,1722型分光光度計(jì)的外形,2.儀器操作鍵介紹 “方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式 “100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比 “波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長(zhǎng),3.樣品測(cè)試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上 打開樣品室蓋，

5、將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路 蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A 將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù) 實(shí)驗(yàn)完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。,返回,返回,返回,五、操作方法,（一）對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取5支試管編號(hào),0號(hào)一支,17號(hào)各二支,按下表操作： 管 號(hào) 0

6、1 2 3 4 5 6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以對(duì)硝基苯酚的絕對(duì)量(mol數(shù))為橫坐標(biāo)，OD405nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)()值。,

7、(二）測(cè)定 15支試管，1-5做兩組平行測(cè)定管，01-05作為空白對(duì)照。 No. 1 2 3 4 5 底物終濃度S (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸餾水（mL ） 0.5 0.45 0.4 0.3 0 碳酸鹽緩沖液（mL ） 各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2 mL 預(yù)熱 混勻，37，5分鐘 酶液（mL ） 測(cè)定管各加0.2 mL酶液 反應(yīng)時(shí)間 37，精確反應(yīng)10分鐘 0.1 mol/L NaOH（mL） 各加2 mL 酶液（mL ） 空白管各補(bǔ)加0.2 mL酶液 OD405,（三） 數(shù)據(jù)處理 各管在722分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)405nm的OD值(OD405nm)。從對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出OD405nm相當(dāng)于產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的含量(mol數(shù)),計(jì)算出各種底物濃度下的初速度vo（單位以molL-1min-1表示），取倒數(shù)1/v填入表內(nèi)。以1/v對(duì)1/S作圖，求出酶催化pNPP水解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm。,六、 注意事項(xiàng) 取液量一定要準(zhǔn)確。 反應(yīng)時(shí)間一定要精確。 加酶前后一定要將試劑混勻。 空白