1、第二章 植物組織培養(yǎng) 的基本原理,影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素,細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化,器官發(fā)生,體細(xì)胞胚胎發(fā)生,知識(shí)點(diǎn):,基本概念：植物細(xì)胞全能性、細(xì)胞分化、 脫分化、再分化 植物離體培養(yǎng)中再生植株有哪些途徑？ 愈傷組織是如何形成與生長的？ 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生有哪些途徑？ 影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？,？,第一節(jié) 植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化,植物組織培養(yǎng)的核心理論： 植物細(xì)胞全能性理論（Haberlandt, 1902）。,細(xì)胞全能性概述,細(xì)胞脫分化,細(xì)胞再分化,定義：1902年由Haberlandt提出，即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。 20世紀(jì)80年

2、代，每一個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。,一、植物細(xì)胞的全能性（Totipotency）,從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株,植物細(xì)胞全能性的證明是通過1958年Steward等胡蘿卜根段細(xì)胞體胚發(fā)生試驗(yàn)及1964年Guha等進(jìn)行的曼陀羅花藥培養(yǎng)。,細(xì)胞全能性的相對性: 細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物; 動(dòng)植細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異.,細(xì)胞按照分裂能力分為三類:,第一類是始終保持分裂能力,如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞； 第二類是永久失去分裂能力的終端分

3、化細(xì)胞，如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞； 第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動(dòng)分裂的細(xì)胞。如表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。,一個(gè)植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。,根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱: 營養(yǎng)生長中心形成層薄壁細(xì)胞厚壁細(xì)胞（木質(zhì)化細(xì)胞）特化細(xì)胞（篩管、導(dǎo)管細(xì)胞） 根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱： 頂端分生組織居間分生組織側(cè)生分生組織薄壁組織（基本組織）厚角組織輔導(dǎo)組織厚壁組織,植物細(xì)胞全能性理論是植物組織培養(yǎng)的核心理論。離體細(xì)胞具有生命的特征屬性，在全能性的基礎(chǔ)上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細(xì)胞經(jīng)歷脫分化（dediff

4、erentiation）和再分化（redifferentiation）過程，可形成再生植物。,1、定義： 分化（differentiation）：是指植物體各個(gè)部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，體現(xiàn)在細(xì)胞分化、組織分化、器官分化三個(gè)水平上。 細(xì)胞分化：指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。是基因選擇性活化或阻遏的結(jié)果。 細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。,二、植物細(xì)胞分化,2、植物細(xì)胞分化的某些規(guī)律和機(jī)理,（1） 細(xì)胞分化分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。 （2）植物中細(xì)胞發(fā)育的途徑一旦被“決定”（de

5、termination），通常不易改變。而離體培養(yǎng)可以通過脫分化而喪失這種“決定”。 （3）分化與極性（Polarity）關(guān)系密切。,（4） 細(xì)胞分裂對細(xì)胞分化具有重要作用。特定環(huán)境條件下進(jìn)行的細(xì)胞分裂可以導(dǎo)致特定的細(xì)胞分化，由不等分裂形成的分化細(xì)胞說明了細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化中的作用。 （5）植物生長調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長素與分裂素比值，高，促進(jìn)生根；低，促進(jìn)長芽。 （6）染色體和DNA的變化對細(xì)胞分化影響比較大。如核內(nèi)多倍體的形成。,三、細(xì)胞脫分化 1、脫分化（Dedifferentiation）：也稱去分化，指離體條件下生長的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而

6、恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或不分化細(xì)胞的過程。 如葉柄基部的薄壁細(xì)胞成為離層細(xì)胞；傷害導(dǎo)致局部細(xì)胞形成愈傷組織。,脫分化誘導(dǎo)期間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。但目前對于脫分化的機(jī)理尚未完全闡明。,2、脫分化的機(jī)理,（1）損傷。切割損傷的刺激，促使細(xì)胞增殖。 （2）在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)常加入生長素類，但同時(shí)配合細(xì)胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。 （4）細(xì)胞位置。外植體本身的各類細(xì)胞可能對培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。 （5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)

7、都會(huì)有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。 （6）植物種類的差異。 一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。,3、影響脫分化的主要因素,三、愈傷組織（callus）培養(yǎng) 、愈傷組織的形成 在細(xì)胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細(xì)胞往往是異質(zhì)性的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。,黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織,誘導(dǎo)期（起動(dòng)期）：是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。細(xì)胞大小幾不變，內(nèi)部發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。 分裂期：外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞必分化，及時(shí)轉(zhuǎn)移，其可無限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不

8、分化狀態(tài)。 分化期：細(xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。,形成過程（三個(gè)時(shí)期）：,（1）生長：誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞分裂，在組織受傷表面形成一層愈傷組織， 細(xì)胞數(shù)目迅速增多，表層細(xì)胞平均重量下降，體積變??；降低溫度，可以使細(xì)胞生長速度減慢，平均大小可增加。 （2）質(zhì)地類型：松脆和致密兩種。高濃度生長素，可使Callus變得松脆；高濃度細(xì)胞分裂素，則可使致密。 （3）生理生化變化：次生物質(zhì)合成能力變化，對激素的需求變化等。,2、愈傷組織的生長,3、愈傷組織的保持 轉(zhuǎn)接,在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長，Callus長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降

9、低甚至死亡。所以在此之前，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基上。 主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變； 生理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對外源生長物質(zhì)的敏感性改變。后者可以通過調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)。,4、愈傷組織形態(tài)發(fā)生,（1）過程：外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形成微管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)。 （2）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。,器官發(fā)生,體細(xì)胞胚胎發(fā)生,四、細(xì)胞再分化（redifferentiation） 1、概念 ：指離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株。,

10、組織培養(yǎng)中的再分化包括下面4個(gè)水平：,細(xì)胞水平的再分化 組織水平的再分化 器官水平的再分化（器官發(fā)生） 植株水平的分化（植株再生）,細(xì)胞水平的再分化：愈傷組織生長、不斷分裂，分化出不同的細(xì)胞類群。主要有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、石細(xì)胞、纖維細(xì)胞等。,組織水平的再分化：在高水平生長素條件下，最常見的是微管束（Vascular tissue）的分化。松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。,器官水平的再分化：由分化出的不同組織形成各種器官，如芽、莖、葉、根等。 根據(jù)起源不同，分為兩種類型： 直接器官發(fā)生（器官型）：直接從外植體的細(xì)胞

11、形成器官原基，然后發(fā)育成器官。 間接器官發(fā)生（器官發(fā)生型）：先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基，后形成不同器官。,植株水平的再分化（植株再生）：根、莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建。先誘導(dǎo)分化出芽，后形成根較好。 離體培養(yǎng)中再生植株的主要途徑有： 器官發(fā)生 胚胎發(fā)生,2、影響細(xì)胞再分化因素： 從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過再分化可獲 得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能讓所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物種類再分化的能力差異很大； （2）對某些植物再生條件還沒有完全掌握。,第二節(jié) 離體條件下植物器官發(fā)生,植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組

12、織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成根、芽、莖等器官的過程。不定根、不定芽是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。,一、器官發(fā)生再生植株的方式： A 先形成芽，芽的基部后產(chǎn)生后根； B 先形成根，根上再出芽； C 愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來.,二、器官發(fā)生的過程： 分為兩種： 經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生 不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生,經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程,愈傷組織形成,生長中心形成,器官原基及器官形成,不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程,有兩種情況： 外植體直接發(fā)生芽 莖尖培養(yǎng)中芽形成,第三節(jié) 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生,一、什么是植物體

13、細(xì)胞胚胎發(fā)生？ 定義：植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，其形成也經(jīng)歷一個(gè)類似合子胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，這種現(xiàn)象稱為植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生，形成的類似胚的結(jié)構(gòu)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。 體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有普遍性，目前已在200多種被子植物上觀察到體胚發(fā)生過程。,合子胚的 發(fā)生過程,雙子葉植物胚胎發(fā)生： 合子原胚球形胚心型胚魚雷胚子葉胚 單子葉植物胚胎發(fā)生： 合子原胚球形胚盾型胚子葉胚 體細(xì)胞胚胎發(fā)生與合子胚發(fā)生階段類似，但體胚形成由體細(xì)胞（或小孢子等性細(xì)胞）形成。,合子心型胚 正在萌發(fā)的體胚,合子胚與體胚比較,1、發(fā)生過程： 一般分為5個(gè)階段：胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎早期

14、分化發(fā)育、體細(xì)胞胚胎成熟、體細(xì)胞胚胎萌發(fā)和成苗。 雙子葉植物：體胚經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚到子葉胚等階段。 單子葉植物：與雙子葉植物誘導(dǎo)發(fā)生過程類似，只是在形態(tài)上無魚雷形胚等階段，成熟體胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等結(jié)構(gòu)。,二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程,挪威云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚生長狀態(tài),針葉松體細(xì)胞胚及體胚萌發(fā)生長,（1） 胚性愈傷組織，通常較小，近圓形，具有較大的核和核仁，并高度染色，胞質(zhì)濃厚。典型的胚性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。 （2）胚性細(xì)胞DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍，淀粉、可溶性糖含量增加，內(nèi)源多胺含量升高，同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。 如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非

15、胚性愈傷組織的1540倍。,2、胚性和非胚性細(xì)胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異,3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因表達(dá)機(jī)理,植物體胚發(fā)生的過程非常復(fù)雜，牽涉到4000多個(gè)相關(guān)基因，以體胚發(fā)育后期，表達(dá)的基因可達(dá)1000多個(gè)。 在植物體胚發(fā)生過程中，會(huì)出現(xiàn)與基因表達(dá)有關(guān)的一系列生物大分子的有規(guī)律變化. 如蛋白質(zhì)含量變化和特異蛋白質(zhì)（胚性蛋白）出現(xiàn)與消失。 由于其復(fù)雜性，目前對體胚發(fā)生的機(jī)制了解不多。,三、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑,1、直接途徑：指從外植體某些部位的胚性細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚胎，如子葉、花序、珠心等外植體。,Direct somatic embryogenesis in Brassica nap

16、us,外植體先脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織的某些細(xì)胞重新“決定”為胚性細(xì)胞，進(jìn)而分化出體細(xì)胞胚胎。多數(shù)體細(xì)胞胚胎通過該途徑形成的。通常包括2個(gè)階段： （1）胚胎發(fā)生叢（Embryogenic clump）EC是由液泡小、細(xì)胞質(zhì)濃的小細(xì)胞構(gòu)成。 （2）胚狀體的發(fā)育。將EC轉(zhuǎn)入降低或除去生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。,2、間接途徑:,Somatic Embryogenesis Induction in Delonix regia (Boger.) Raf (Royal Poinciana),花椰菜體胚發(fā)育的不同階段,菊花花瓣體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過程的掃描電鏡觀察,四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生

17、的機(jī)理 1、體細(xì)胞胚胎的起源： 起源存在爭論，但絕大多數(shù)體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞。 細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化，即細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)部分基因開放，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。,2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理： 體胚具有兩個(gè)明顯特點(diǎn)：極性和生理隔離 極性：單個(gè)胚性細(xì)胞第一次分裂多為不均等分裂，頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。極性獲得的誘因是激素和外界刺激。 生理隔離：在早期胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞存在胞間連絲，但是隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育，細(xì)胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（類似小孢子發(fā)生）。,3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的的生理生化： （1）蛋白質(zhì)與核酸代謝； （2）多胺代謝變化； （3）糖

18、類、礦質(zhì)營養(yǎng)變化； （4）內(nèi)源激素變化； （5）活性氧代謝變化 。,第四節(jié) 影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素,一、植物種類和基因型 1、植物種類不同難易程度不同；被子植物比裸子植物容易。 2、同一物種不同基因型間存在較大差別。 二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài) 1、發(fā)育年齡：一般幼態(tài)比老態(tài)組織形態(tài)發(fā)生能力高； 2、培養(yǎng)器官或組織類型：細(xì)胞分裂旺盛的器官較好； 3、培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性：一般取處于旺盛生長期的愈傷來誘導(dǎo)器官形成。,三、 培養(yǎng)基,1、營養(yǎng)成分 一般認(rèn)為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮和K+有利于胚狀體形成，提高無機(jī)磷的含量可促進(jìn)器官發(fā)生。 莖尖培養(yǎng)和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要是MS及其修改的培養(yǎng)和B5培養(yǎng)基。 莖尖培養(yǎng)的起始培養(yǎng)基和芽增殖的培養(yǎng)基往往是不同。 碳水化合物種類及濃度對胚狀體發(fā)育有重要作用。缺糖或低糖無法形成胚狀體。,2. 植物激素及生長調(diào)節(jié)劑（起