1、,生物檢測(cè)技術(shù),韶關(guān)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 易道生 Office：英東樓B-301 Mp662492 Email：,內(nèi)容,主要由六個(gè)模塊構(gòu)成： 生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù) 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 生物檢測(cè)儀器,第一章 生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù),內(nèi)容,第一節(jié)電泳技術(shù) 第二節(jié)光譜分析技術(shù) 第三節(jié)生物大分子含量測(cè)定 第四節(jié)色譜分析技術(shù) 第五節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),目標(biāo),掌握瓊脂糖電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和操作要點(diǎn)。 掌握可見(jiàn)光和紫外光的分光光度技術(shù)的原理和方法。 理解各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 理解各種核酸含量測(cè)定技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)

2、。,第一節(jié) 電泳檢測(cè)技術(shù),電泳：帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。 1809年由俄國(guó)人發(fā)現(xiàn)。 1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳法”，成功地分離血清蛋白質(zhì)各成分。 50年代，改進(jìn)電泳儀，尋找合適的電泳支持介質(zhì)，先后找到濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物。 60年代，找到聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這些技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。 目前，電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及與其密切相關(guān)學(xué)科分析中必不可少的手段。,電泳槽和大分子分離結(jié)果,電泳技術(shù)分類,從實(shí)際和實(shí)用出發(fā)的分

3、類,根據(jù)分離樣品樣品的數(shù)量和目的分制備和分析電泳 根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)分免疫、層析、等電聚焦、轉(zhuǎn)移、雙向、脈沖梯度電場(chǎng)、垂直交替凝膠電泳等 根據(jù)使用電壓分常壓（500）和高壓電泳。 根據(jù)電泳系統(tǒng)pH連續(xù)與否分連續(xù)和不連續(xù)pH電泳 根據(jù)介質(zhì)使用與否分自由和區(qū)帶電泳（濾紙、薄層、凝膠電泳） 根據(jù)電泳槽的形式分有 垂直的、水平的、柱狀的、板狀的、毛細(xì)管的、濕小室及幕狀的。 毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代研制出的一種新型的區(qū)帶電泳方法，具有分辨率好、靈敏度高、檢測(cè)快捷等特點(diǎn)。,自由電泳 可分為： 顯微電泳（也稱細(xì)胞電泳），是在顯微鏡下觀察細(xì)胞或細(xì)菌的電泳行為； 移界電泳； 柱電泳； 自由流動(dòng)幕電泳； 等速

4、電泳等。 支持物電泳 根據(jù)支持物的特點(diǎn)又可分為： 紙電泳 薄層電泳 醋酸纖維素薄膜電泳 非凝膠性支持物區(qū)帶電泳 (支持物有：淀 粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠等) 凝膠區(qū)帶電泳：淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰 胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳。,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,11,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,12,電泳基本原理,電泳是不同的物質(zhì)顆粒在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷及顆粒大小形狀等不同，因此向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的一種方法。 在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特

5、定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。,帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度稱遷移率或泳動(dòng)度。 電泳時(shí)，帶電顆粒（球形）在介質(zhì)中受力平衡勻速運(yùn)動(dòng)，則有： v = F阻/f = FE/f = Eq/f = Eq/(6r) v 泳動(dòng)度 F阻 顆粒所受阻力 FE 顆粒所受電場(chǎng)力 f 摩擦系數(shù) 由上式可見(jiàn)：泳動(dòng)度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷以及電場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)。 非球形分子（如線狀DNA）在電泳過(guò)程中受到更大的阻力，即粒子的泳動(dòng)度與粒子形狀有關(guān)。,E 電場(chǎng)強(qiáng)度 q 顆粒所帶電荷 r 顆粒半徑 介質(zhì)黏度,相對(duì)遷移率（Rf）： 分離區(qū)帶的泳動(dòng)速度可用相對(duì)遷移

6、率來(lái)表示。 測(cè)定遷移率時(shí)，在電泳結(jié)束后要先在指示劑移動(dòng)的位置（前沿）作一標(biāo)記（通常是插一根短銅絲），染色后，量出指示劑移動(dòng)的距離和酶帶移動(dòng)的距離。 Rf 譜帶遷移距離/ 前沿指示劑遷移距離 測(cè)量遷移率時(shí)，應(yīng)以譜帶的中部位置為準(zhǔn)，值得注意的是，交聯(lián)劑的濃度，交聯(lián)劑和丙烯酰胺的比例，催化劑濃度及聚膠時(shí)的溫度和時(shí)間均對(duì)凝膠柱結(jié)構(gòu)有影響，因而會(huì)影響遷移率。 另外，電泳時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度等也會(huì)影響帶電顆粒遷移速度。為了使試驗(yàn)重復(fù)性好，這些因子都應(yīng)盡可能保持恒定。,一、瓊脂糖凝膠電泳,1、原理：瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主

7、要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,以對(duì)于分子量大的樣品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。 瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)： 天然瓊脂是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。 瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖是直鏈多糖，它

8、由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列織成。,2、操作方法 試劑與設(shè)備,上樣buffer 0.25%溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍(lán) ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液 以上溶液4 保存?zhèn)溆谩?制膠： 稱干粉，融化，倒膠，插梳子，凝固，裝電泳槽。,3、步驟 1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并搖勻。） 用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固。 充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1T

9、AE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4l于封口膜上，再加入2l 的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。, 將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到發(fā)出熒光的DNA條帶。,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，瓊脂糖是經(jīng)過(guò)挑選，以質(zhì)地較純的瓊脂作為原料而制成的。 優(yōu)點(diǎn)如下： 瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳。

10、瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。 瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定。 電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。,目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合 ，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1g蛋白質(zhì)就可檢出。 瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，需樣品量少，分辨能力

11、高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn) 方法之一。,2020/9/5,韶關(guān)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,25,PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳,2020/9/5,26,引物二聚體,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,27,4、影響因素 1）瓊脂糖 來(lái)源，純度。酸根取代導(dǎo)致Agarose帶電。 對(duì)支持物的一般要求是均勻，吸附力和電滲小，機(jī)械性能好，便于染色或紫外光下檢測(cè)，故最好透明，無(wú)紫外吸收。常用的支持物有濾紙，醋酸纖維素薄膜，淀粉凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠等。支持物性質(zhì)不同也會(huì)影響泳動(dòng)速率，如瓊脂于聚丙烯酰胺凝膠都有大小不同的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒的泳動(dòng)速率快，反之則慢。 2）膠濃度,3） 電場(chǎng)

12、強(qiáng)度： 電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢(shì)梯度)。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，則帶電顆粒泳動(dòng)越快。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度的不同，電泳可分為： 常壓(100-500V)電泳。其電場(chǎng)強(qiáng)度為2-10V/cm。分離時(shí)間較長(zhǎng)，從數(shù)小時(shí)到數(shù)十小時(shí) ，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。 高壓(2000-10000V)電泳。其電場(chǎng)強(qiáng)度為50-200V/cm，電泳時(shí)間很短，有時(shí)只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。,4） 溶液pH 為使電泳時(shí)pH值恒定，必須采用緩沖液作為電極液，溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。 對(duì)蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶的凈電荷越多，

13、泳動(dòng)速度也越快；反之，則越慢。因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時(shí)，應(yīng)選擇合適的pH使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異。,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,31,5） 溶液的離子強(qiáng)度 緩沖液離子強(qiáng)度越高，則顆粒的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)度也越小。一般最適合的離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。溶液離子強(qiáng)度(ionic strength)的計(jì)算公式如下： I=1/2cz2 式中，I為離子強(qiáng)度，c為離子的摩爾濃度(mol/L)，z為離子價(jià)數(shù)，價(jià)數(shù)越高，則離子強(qiáng)度越大。 6） 電滲 電泳緩沖液相對(duì)于固體支持物的移動(dòng)稱電滲。如紙電泳時(shí)，濾紙吸附OH-離子帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動(dòng)

14、，會(huì)對(duì)顆粒的移動(dòng)造成不良影 響，故電泳時(shí)，電滲 小些為好。,7） 溫度 電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加快，遷移率增加，同時(shí)溫度過(guò)高會(huì)使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時(shí)，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。 8）支持物 現(xiàn)代電泳多在固體支持物上進(jìn)行，使樣品中的不同組分形成不同的區(qū)帶，稱區(qū)帶電泳。電泳結(jié)束后，支持物可以方便地進(jìn)行染色等后續(xù)處理。,印跡轉(zhuǎn)移電泳： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對(duì)電泳分離后的DNA進(jìn)行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作 1975年，Southern創(chuàng)造了將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上，再進(jìn)行雜

15、交的方法，被稱為Southern印跡法。 隨后出現(xiàn)RNA印跡（被戲稱為Northern印跡），蛋白質(zhì)印記（ Western印跡）等。,交變脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因?yàn)樵诃傊悄z中，DNA分子的有效直徑超過(guò)凝膠孔徑時(shí)，在電場(chǎng)作用下，迫使DNA變形擠過(guò)篩孔，而沿著泳動(dòng)方向伸直，因而分子大小對(duì)遷移率影響不大。 如此時(shí)改變電場(chǎng)方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動(dòng)方向伸直，而轉(zhuǎn)向時(shí)間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。 1983年，Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時(shí)間（外推為零的滯留時(shí)間）與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計(jì)了脈沖電場(chǎng)梯度凝膠。Ca

16、rle等改進(jìn)了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(chǎng)亦能使大分子 DNA 通過(guò)電泳分開(kāi)。,該電泳系統(tǒng)是由一個(gè)水平式電泳槽和兩組獨(dú)立，彼此垂直的電極組成，一組電極負(fù)極為N，正極為S；另一組負(fù)極為W，正極為E 。一塊正方形瓊脂糖凝膠板呈45置于中央，電場(chǎng)在N-S和W-E之間交替建立。 電場(chǎng)交替改變的時(shí)間長(zhǎng)短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時(shí)，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場(chǎng)中。首先向S極移動(dòng)，然后改向E極。在每次電場(chǎng)方向改變時(shí)，DNA分子就要有一定的時(shí)間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達(dá)到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前進(jìn)。DNA分子凈移動(dòng)方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交

17、變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬(wàn)bp的大分子DNA。,4.4. 交變脈沖電場(chǎng)凝膠電泳,免疫電泳： 免疫電泳是以瓊脂（糖）為支持物，在免疫的基礎(chǔ)上，將瓊脂（糖）區(qū)帶電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合產(chǎn)生特異性的沉淀線、弧或峰。 此技術(shù)的特點(diǎn)： 樣品用量極少，免疫識(shí)別具有專一性，分辨率高。 在瓊脂糖免疫雙擴(kuò)散的基礎(chǔ)上發(fā)展了多種免疫電泳，如微量免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、單向定量免疫電泳（火箭電泳）、放射免疫電泳及雙向定量免疫電泳等。 上述各種電泳有其共性，但又有不同的操作方法及原理，詳見(jiàn)后續(xù)章節(jié)。,二、RNA電泳檢測(cè) 1、原理與過(guò)程 RNA電泳基本同DNA電泳一樣。 但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏

18、感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來(lái)配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解。 另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。,2、試劑設(shè)備 試劑: 5 X MOPS電泳緩沖液：20.9g MOPS (0.1mol/L), pH7.0; 8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L); 10.0ml 0.5mol/L EDTA (5mmol/L) pH8.0, 用水定容至1L. 以上藥品和水均需用DEPC處理。 10 x甲醛上樣緩沖液：1mmol/L EDTA, p

19、H8.0; 0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯藍(lán)，50%甘油). 37% 甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）; 甲酰胺; 10mg/ml溴化乙錠. 以上藥品和水均需用DEPC處理。,3、步驟 膠的制備：1.5g瓊脂糖加115ml水，加熱融化。冷卻至60時(shí)加30ml的5 X MOPS電泳緩沖液 (終濃度為1X); 加5ml甲醛（瓊脂糖終濃度為1%）。制膠。 樣品制備： RNA (最多30ug) 5.5ul 5 X MOPS電泳緩沖液 2.0ul 甲醛 3.5ul 甲酰胺 10ul 在65下處理15min, 然后置冰上。 加樣品前，先用5v/cm電壓電泳5分鐘。 制備好的樣品短暫離心后加

20、10X上樣緩沖液2ul，混勻。 上樣。 在1 X MOPS電泳緩沖液中電泳2-3小時(shí)。在電泳1-2小時(shí)后，可混合正負(fù)極緩沖液，再繼續(xù)電泳。 染色：將電泳好的膠板轉(zhuǎn)移至含0.5ug/L溴化乙錠的0.1mmol/L NH4AC溶液中染色30-40min. （溴化乙錠也可以在電泳前加于樣品中）,4、影響因素 1）Agarose 來(lái)源，純度。 2）膠濃度 3）以乙二醛DSMO做變性系統(tǒng)時(shí)，制膠時(shí)不加EB，電泳后浸膠入EB溶液。并需要buffer循環(huán)系統(tǒng)，避免形成過(guò)高的pH梯度。 4）避免RNA因RNase污染而降解。,三、 聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N

21、-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱PAGE）。,聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)： 在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好。 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。 幾乎無(wú)電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。 樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。 凝膠孔徑可通過(guò)選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,聚丙烯酰胺凝膠于瓊脂糖凝

22、膠的不同之處： 分離范圍不同 瓊脂糖凝膠電泳分離分子量比較大的物質(zhì)，尤其是核酸； 聚丙烯酰胺凝膠分離分子量較小的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，氨基酸等。 凝膠配置程序不同 瓊脂糖凝膠在緩沖液中加熱融化，在凝固前到入槽中即可； 聚丙烯酰胺凝膠在配置時(shí)還要加多種成分，并且對(duì)聚合溫度也有一定的要求，否則會(huì)影響凝膠孔徑的大小。 凝膠的厚度不同 瓊脂糖凝膠最薄只能達(dá)到； 聚丙烯酰胺凝膠可以制成.，分辨率高。 成本不同。瓊脂糖價(jià)格便宜；聚丙烯酰胺凝膠價(jià)格較高 安全性不同。瓊脂糖沒(méi)有毒性；聚丙烯酰胺凝膠有毒性,PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備， 還可測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量、等電

23、點(diǎn)等。 聚丙烯酰胺凝膠電泳又有以下幾種： 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 連續(xù)密度梯度電泳 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳,1、 凝膠聚合的原理及有關(guān)特性 1.1. 聚合反應(yīng),聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。 催化系統(tǒng)常用有兩種： 過(guò)硫酸氨TEMED化學(xué)催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過(guò)硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng)，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。 核黃素TEM

24、ED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,49,1.2. 凝膠孔徑的可調(diào)性及其有關(guān)性質(zhì) 凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系：凝膠的孔徑、機(jī)械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。 T Acr和Bis總濃度 C 交聯(lián)劑百分比 V 緩沖液體積(mL) a/b(W/W)與凝膠的機(jī)械性能密切相關(guān)。當(dāng)a/b10時(shí)，凝膠脆而易碎，堅(jiān)硬呈乳白色；a/b100時(shí)，即使5%的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全

25、透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制a/b=30左右。,a Acr克數(shù) b Bis克數(shù),不同濃度的單體對(duì)凝膠性能影響很大。Davis的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Acr2%，Bis0.5%，凝膠就不能聚合。當(dāng)增加Acr濃度時(shí)要適當(dāng)降低Bis的濃度。 通常，T為2%-5%時(shí)，a/b=20左右；T為5%-10%時(shí)，a/b=40左右；T為15%-20%時(shí)，a/b=125-200左右，為此Richard等(1965)提出一個(gè)選擇c和T的經(jīng)驗(yàn)公式； C = 6.50.3T 此公式適用于T為5-20%范圍內(nèi)的c值，其值可有1%的變化。 在研究大分子核酸時(shí)，常用T= 2.4 %的大孔凝膠，此時(shí)凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖。

26、在T=3%時(shí)，也可加入20%蔗糖以增加機(jī)械性能，此時(shí)，并不影響凝膠孔徑的大小。,凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機(jī)械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān)系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時(shí)，孔徑最小。 凝膠濃度與被分離物相對(duì)分子量質(zhì)的關(guān)系： 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過(guò)可移動(dòng)顆粒的相對(duì)分子質(zhì)量也不同。 在操作時(shí)，可根據(jù)被分離物相對(duì)分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標(biāo)準(zhǔn)膠)，因?yàn)樯矬w內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時(shí)也可用4%-10%的

27、梯度膠測(cè)試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。,2020/9/5,韶關(guān)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,53,1.3. 影響凝膠聚合的因素 Acr及Bis的純度：應(yīng)選用分析純的Acr及Bis，兩者均為白色結(jié)晶物質(zhì)， 280無(wú)吸收。如試劑不純，含有雜質(zhì)或丙烯酸時(shí)，則凝膠聚合不均一，或聚合時(shí)間延長(zhǎng)甚至不聚合， 因而需進(jìn)一步純化。 Acr及Bis固體應(yīng)避光，貯存在棕色瓶中，因自然光、超聲波及射線均可引起Acr自身聚合或形成亞胺橋而交聯(lián)，造成試劑失效。 Acr和Bis貯液的pH值為4.9-5.2，當(dāng)pH值的改變大于0.4pH單位則不能使用，因在偏酸或偏堿的環(huán)境中，它們可不斷水解放出丙烯酸和NH4+ 而

28、引起pH值改變，從而影響凝膠聚合。 因此，配制的Acr和Bis貯液應(yīng)置棕色瓶中，4貯存 ，存放期一般不超過(guò)1-2個(gè)月為宜。,AP、核黃素、TEMED：是凝膠聚合不可缺少的試劑，AP應(yīng)在干燥、避光的條件下保存，其水溶液應(yīng)置棕色瓶中，4冰箱貯存，一般僅能存放一周。TEMED（液狀）應(yīng)密閉貯于4冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過(guò)量的AP和TEMED會(huì)引起電泳時(shí)燒膠和譜帶變形。應(yīng)選擇合適的配方使聚合在40-60min內(nèi)完成。 pH：堿性條件下聚合快，但堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)膠硬而脆，需高pH時(shí)應(yīng)減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進(jìn)聚合。 溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時(shí)易產(chǎn)生

29、小氣泡，低溫(5)聚合凝膠會(huì)變得脆 而混濁，一般25-35聚合較好。 氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠最好先抽真空脫氣，再加引發(fā)劑。,2、 PAGE原理（非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳） PAGE電泳據(jù)電泳裝置不同分為垂直的圓盤(pán)及板狀兩種。 前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤(pán)狀，因而稱為圓盤(pán)電泳； 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。,蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE時(shí)，常用垂直板電泳。 垂直板電泳的優(yōu)越性有： 表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。 在同一塊膠板上可同時(shí)進(jìn)行10個(gè)以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分

30、析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。 膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。 膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長(zhǎng)期保存與掃描。 可進(jìn)行雙向電泳。,PAGE據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)

31、性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進(jìn)行分離。,根據(jù)緩沖液的PH值的高低，可分為堿性系統(tǒng)、酸性系統(tǒng)和中性系統(tǒng)。 不連續(xù)體系由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠組成，排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。 樣品膠的作用是防止對(duì)流，促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋。目前一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40%蔗糖，同樣具有防止對(duì)流及樣品被稀釋的作用。,濃縮膠是樣品膠的延續(xù)，凝膠濃度及pH值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進(jìn)入分離膠前，被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。 分離膠的T=7.0%-7.5%，C=2.5%，緩沖液為pH8.9的Tr

32、is-HCl，大部分蛋白質(zhì)在此pH條件下帶負(fù)電荷。此膠主要起分子篩作用。,2.1. 樣品濃縮效應(yīng) 凝膠孔徑的不連續(xù)性： 上述3層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在 電場(chǎng)作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動(dòng)的阻力小，移動(dòng)速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，受到的阻力大，移動(dòng)速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。 電位梯度的不連續(xù)性： 電泳開(kāi)始后，快離子的快速移動(dòng)會(huì)在其后 形成一個(gè)離子強(qiáng)度很低的低電導(dǎo)區(qū)，使局 部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的 區(qū)帶。,緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性： 在三層凝膠中均有Tris及HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖

33、配對(duì)離子。HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl ，在電場(chǎng)中遷移率快，走在最前面稱為快離子。 電極緩沖液中，除有Tris 外還有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.3的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1%-1%，因而在電場(chǎng)中遷移很慢，稱為慢離子。 血清中大多數(shù)蛋白質(zhì)pI在5.0左右，在pH6.7或8.3時(shí)均帶負(fù)電荷向正極移動(dòng)，遷移率介于快離子與慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區(qū)帶。當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)；因此Cl及甘氨酸根沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于相對(duì)分子質(zhì)

34、量大，被留在后面，逐漸分成多個(gè)區(qū)帶。,2.2.分子篩效應(yīng) 大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ，這就是分子篩效應(yīng)。 當(dāng)被濃縮的蛋白質(zhì)樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí)，pH值和凝膠孔徑突然改變，分離膠的pH值8.9接近甘氨酸的Pka值（9.79.8），這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動(dòng)率也增加。此時(shí)慢離子的有效泳動(dòng)率超過(guò)了所有蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率。這樣，高電勢(shì)梯度不存在了，各種蛋白質(zhì)僅會(huì)由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個(gè)均一的電勢(shì)梯度和pH條件下通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動(dòng)率的不同而被分開(kāi)。 這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)

35、，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。,2.3. 電荷效應(yīng) 蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同，因而泳動(dòng)率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)區(qū)帶。在進(jìn)入分離膠時(shí)，電荷效應(yīng)仍起作用。 目前，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣，雖然電泳過(guò)程中無(wú)濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質(zhì)、酶、核酸等活性物質(zhì)變性失活，也顯示了它的優(yōu)越性。,變性PAGE原理 聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。 所謂非變性凝膠，即在凝膠中不加變性劑，這種凝膠中，蛋白質(zhì)的遷移率受它的

36、靜電荷與分子大小兩個(gè)因素的影響。因此在非變性凝膠中進(jìn)行電泳是不能測(cè)得分子量的。 所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，把絕大部分蛋白質(zhì)分離成組成它們的亞基。同時(shí)在蛋白質(zhì)分子周圍包圍了大量負(fù)電荷。這種電荷基本上掩蓋了無(wú)變性劑存在時(shí)正常就有的任何電荷。蛋白質(zhì)在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。因此利用變性凝膠進(jìn)行電泳可以測(cè)得蛋白質(zhì)的分子量。目前應(yīng)用較多的變性劑為SDS。,變性PAGE原理 SDS-PAGE時(shí)，在蛋白質(zhì)溶解液中加入SDS和疏基乙醇。 巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分

37、成單個(gè)亞單位。 SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，并形成復(fù)合物。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們?cè)谒芤褐械男螤罱蒲┣研蔚拈L(zhǎng)橢圓棒。 不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合 物的短軸相同 ，約1.8 nm，而長(zhǎng)軸則與蛋白 質(zhì)的Mr成正比。,目前，用SDS-PAGE研究過(guò)的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種，均證實(shí)此法測(cè)定蛋白質(zhì)Mr的可靠性。 測(cè)定未知蛋白質(zhì)Mr時(shí)，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白及適宜的凝膠濃度，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE，則可根據(jù)已知Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率和Mr的對(duì)數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得Mr。 本方法有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣品用量少 ，耗時(shí)少(僅需一天)

38、，分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)Mr測(cè)定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面的研究。,3、試劑與方法（略） 4、影響因素 1）蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合 2）離子強(qiáng)度 3）樣品制備 無(wú)沉淀，顆粒 4）樣品中存在阻礙gel聚合的成分，或易變性成分 5）固定、染色 可能丟失小肽段。,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,70,然而SDS-PAGE也有不足之處，尤其是電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白(如 糖蛋白)

39、及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測(cè)出的Mr不太可靠。 如組蛋白F1，本身帶有大量正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷，故用SDS-PAGE測(cè)得的Mr為35 000， 而用其他方法測(cè)定的Mr僅為21 000。 因此要確定某種蛋白質(zhì)的Mr時(shí)，最好用2種測(cè)定方法互相驗(yàn)證。尤其是對(duì)一些由亞基或兩種以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于SDS及巰基乙醇的作用 ，肽鏈間的二硫鍵被打開(kāi)，解離成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測(cè)定結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的Mr ，還需用其他方法測(cè)定分子中肽鏈的數(shù)目。,連續(xù)密度梯度電泳（PG-PAGE） 原理： 連續(xù)密度梯度電泳使用的是從上至下的一個(gè)正的線性梯度凝膠，點(diǎn)在凝膠頂部的樣品在電場(chǎng)中向

40、著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸縮小的方向遷移。隨著電泳的繼續(xù)進(jìn)行，蛋白質(zhì)受到孔徑的阻力越大。 電泳開(kāi)始時(shí)，樣品在凝膠中的遷移速度主要受到本身的電荷密度和樣品分子的大小的影響。當(dāng)遷移所受到的阻力大到阻以使樣品分子完全停止前進(jìn)時(shí)，那些跑得很慢的低電荷的樣品分子將趕上與它大小相同但具有較高電荷密度的分子并停留下來(lái)形成區(qū)帶。,因此在梯度凝膠電泳中，樣品的最終遷移位置僅取決于分子本身的大小，而與樣品分子的電荷密度無(wú)關(guān)。樣品混合物中分子質(zhì)量大小不同的組分，電泳之后將依分子質(zhì)量大小停留在不同的凝膠孔徑層次中形成相應(yīng)的區(qū)帶。,線性梯度凝膠制備 線性梯度凝膠制備不同于均一濃度凝膠制備，應(yīng)預(yù)先配制低濃度膠（2

41、% 或4%）貯液置貯液瓶中；高濃度膠（16% 或30%）貯液置混合瓶中（兩者體積比為1/1），在梯度混合器及蠕動(dòng)泵的協(xié)助下，從下至上灌膠。凝膠聚合后，則形成從下到上、從濃至稀依次排列的線性梯度凝膠。,PG-PAGE的優(yōu)點(diǎn)： 由于梯度凝膠孔徑的不連續(xù)性，具有使樣品中各個(gè)組分濃縮的作用，稀釋的樣品可以分次上樣，不會(huì)影響分離效果 可提供更清晰的蛋白質(zhì)區(qū)帶，用于蛋白質(zhì)純度的鑒定。 可在一個(gè)凝膠板上同時(shí)測(cè)定數(shù)個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量相差很大的蛋白質(zhì)。 可直接測(cè)定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，而不被解離為亞基。因此，本法可作為SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的補(bǔ)充。 盡管本法有上述優(yōu)點(diǎn)，但主要適用于測(cè)定球狀蛋白

42、質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)纖維狀蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定誤差較大。 另外，由于相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定僅僅是在未知蛋白質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)達(dá)到了被限定的凝膠孔徑時(shí)（即完全被阻止遷移時(shí)）才成立，電泳時(shí)要求足夠高的電壓（一般不低于2000V），否則將得不到預(yù)期的效果。因此，采用PG-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有一定的局限性，需用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。,聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳（ IEF-PAGE ） 原理： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)pHpI時(shí)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；當(dāng)pHpI時(shí)帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；當(dāng)pH=pI時(shí)凈電荷為零，在電場(chǎng)中既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，此時(shí)的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。 聚丙烯

43、酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)的作用下會(huì)自發(fā)形成一個(gè)連續(xù)pH梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離。運(yùn)動(dòng)到等電點(diǎn)膠層時(shí)就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處并聚焦成帶，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)不同，因而在等電聚焦中得到有效的分離。在等電聚焦中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。,兩性電解質(zhì)載體是IEF-PAGE中最關(guān)鍵的試劑，它直接影響pH梯度的形成及蛋白質(zhì)的聚焦。載體兩性電解質(zhì)必須具備的條件： 它的化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物，不干擾被分離物的鑒定。 它的分子量要小，這樣便于與被分離的物質(zhì)分開(kāi)。 具有化學(xué)惰性，不與被分離物質(zhì)反應(yīng)，也不能使被分離物質(zhì)變性。 在等電點(diǎn)處必須具

44、有足夠的緩沖能力。 在等電點(diǎn)處必須具有足夠高的電導(dǎo)，以使一定的電流通過(guò)。,pH梯度的形成： 兩性電解質(zhì)載體是含有一系列pK和pI各自相異卻又相近的脂肪族多氨基多羧基的混合物。將其混入到電泳支持物中，開(kāi)始電泳后，各組分在中性溶液介質(zhì)中都發(fā)生解離，并形成一個(gè)平滑穩(wěn)定的由正極向負(fù)極逐漸上升的pH 梯度。,在防止對(duì)流的情況下，只要有電流存在就可以保持穩(wěn)定的pH 梯度，因?yàn)榇藭r(shí)由于擴(kuò)散和電移動(dòng)所引起的物質(zhì)移動(dòng)處于動(dòng)態(tài)平衡。 在此pH梯度中，各種蛋白質(zhì)遷移到各自的pI處而得到分離。由此可見(jiàn)，該蛋白質(zhì)在“自然”pH 梯度中，無(wú)論處于何種位置均會(huì)向其等電點(diǎn)移動(dòng)，并最終停留在該處。,等電聚焦的優(yōu)點(diǎn)是： 有很高的

45、分辨率，可將等電點(diǎn)相差0.010.02PH單位的蛋白質(zhì)分開(kāi)； 一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響，隨著時(shí)間和所走距離加長(zhǎng)，區(qū)帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶變窄； 由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其等電點(diǎn)處，很稀的樣品也可進(jìn)行分離； 可直接測(cè)出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其精確度可達(dá)0.01PH單位。 缺點(diǎn)： 電聚焦要求用無(wú)鹽溶液，而在無(wú)鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀， 樣品中的成分必需停留于其等電點(diǎn)，不適用于在等電點(diǎn)時(shí)發(fā)生沉淀或變性的蛋白質(zhì),四、 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳 1、原理： 雙向電泳是一種由任意兩個(gè)單向電泳組合而成的，在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳

46、的分離方法。 經(jīng)過(guò)電荷和質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后，可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。,2、電泳方法： 1）制樣 抽提要確保將全部蛋白質(zhì)都提出來(lái)。 2）一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，電泳結(jié)束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行第一向IEF-PAGE，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF-PAGE，只是制膠時(shí)要加入2%兩性電解質(zhì)和6mol/L尿素。 3）第二向電泳時(shí)，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3L 1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，

47、瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時(shí)，停止電泳。第二向電泳時(shí)，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。 4）染色脫色,3、影響因素 1）樣品處理 需除盡鹽、色素、核酸、酚，蛋白質(zhì)需全部提取出來(lái)。 2）樣品越新鮮越好 3）染料靈敏度 4）蛋白質(zhì)的含量、酸堿性、最大最小蛋白質(zhì)的分離程度，對(duì)難溶蛋白的檢測(cè)。,雙向電泳示意圖,電泳目前，已有5000余種蛋白質(zhì)分采用IEF/SDS-PAGE得到很好的分離，其高分辨率是各種類型單向PAGE及其他雙向PAGE所無(wú)法比擬的。因此，IEF/SDS-PAGE雙向電泳已成為當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可廣泛用于生

48、物大分子如蛋白質(zhì)，核酸酶解片段及核糖體蛋白質(zhì)的分離和精細(xì)分析，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基本方法。隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，其應(yīng)用范圍將更加廣泛。 然而，此技術(shù)對(duì)某些堿性蛋白質(zhì)的分離卻有其局限性，因在第一向IEF-PAGE的電泳體系中，含有高濃度的尿素，它的存在會(huì)使堿性區(qū)的pH梯度變得很窄而且不穩(wěn)定，可使堿性蛋白質(zhì)難以進(jìn)入凝膠中或者易泳出凝膠外。因此，對(duì)堿性蛋白質(zhì)的分離分析應(yīng)采用其他方法。,蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)（染色）技術(shù),經(jīng)醋酸纖維薄膜、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的各種生物分子需用染色法使其在支持 物相應(yīng)位置上顯示出譜帶，從而檢測(cè)其純度、含量及生物活性。蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、 核酸及酶等均有不同的染色

49、方法。 蛋白質(zhì)染色 染色液種類繁多，各種染色液染色原理不同，靈敏度各異。使用時(shí)可根據(jù)需要加以選擇。常 用的染色液有： 氨基黑10B 氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用蛋白質(zhì)染料之一，但對(duì)SDS-蛋白質(zhì)染色效果不好。 氨基黑10B染不同蛋白質(zhì)時(shí)，著色度不等、色調(diào)不一，定量時(shí)誤差較大，需要對(duì)各種蛋白質(zhì)作出 本身的蛋白質(zhì)-染料量(吸收值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，更有利于定量測(cè)定。,蛋白質(zhì)染色 考馬斯亮藍(lán)R250（簡(jiǎn)稱CBB R250 ） 考馬斯亮藍(lán)R250的max=560-590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。該染料是 通過(guò)范氏作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋

50、白質(zhì)濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，染色不合科Beer定律，作定量分析時(shí)要注意這點(diǎn)。 考馬斯亮藍(lán)G250 （簡(jiǎn)稱CBB G250 ） 藍(lán)馬斯亮藍(lán)G250的max=590-610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點(diǎn)是在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地使蛋白質(zhì)染色而幾乎無(wú)本底色，所以常用于需要重復(fù)性和穩(wěn)定性的染色，適于用定量分析。（兩種CBB染色法的缺點(diǎn)見(jiàn)本頁(yè)備注） 固綠 固綠的max=625nm，酸性染料。染色靈敏度不如CBB，近似于氨基黑，但卻可克服CB B在脫色時(shí)易溶解出來(lái)的缺點(diǎn)。,蛋白質(zhì)染色 熒光染料 丹磺酰氯：在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)的末端氨基反應(yīng)，使它們獲得熒光性質(zhì)，在波

51、長(zhǎng)320nm或280nm的紫外燈下，觀察染色后的區(qū)帶或斑點(diǎn)。 熒光胺：其作用與丹磺酰氯相似。由于自身及分解產(chǎn)物均不 顯示熒光，因此染色后沒(méi)有熒光背景。只是由于引進(jìn)了負(fù)電荷，會(huì)引起電泳遷移率的改變，但在SDS存在下這種電荷效應(yīng)可忽略。近來(lái)，熒光胺常用于雙向電泳的蛋白染色。 2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮(MDPF)：其作用與熒光胺類似，也是與末端氨基產(chǎn)生 反應(yīng)而產(chǎn)生熒光。 1-苯胺基-8-萘磺酸：常用其鎂鹽，本身無(wú)色，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在紫外光下可見(jiàn)黃綠色熒光。 銀染色法 此法較CBB R250靈敏100倍，染色機(jī)制可能與攝影過(guò)程中Ag+的還原相似。,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命

52、科學(xué)學(xué)院,89,2020/9/5,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,90,糖蛋白染色 過(guò)碘酸-Schiff試劑 阿爾山藍(lán)染色 脂蛋白染色 油紅O染色 蘇丹黑B 核酸的染色 將凝膠先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸鑭等固定，或者將有關(guān)染料與上述溶液配在一起，同時(shí)固定與染色。有的染色液可同時(shí)染DNA及RNA，如stains-all、 溴乙錠熒光染料等，也有RNA，DNA各自特殊的染色法。,核酸的染色 RNA染色法 焦寧：其對(duì)RNA染色效果好，靈敏度高。脫色后凝膠本底顏色淺而RNA 色帶穩(wěn)定，抗光且不易褪色。此染料最適濃度為0.5%。低于0.5%則RNA色帶較淺；高于0.5% 也并不能增

53、加對(duì)RNA染色效果。 甲苯胺藍(lán)O：其最適濃度為0.7%，染色效果較焦寧Y稍差些。 次甲基藍(lán)：染色效果不如焦寧Y和甲苯胺藍(lán)O，檢出靈敏度較差，一般 在5g以上；染色后RNA條帶寬，且不穩(wěn)定，時(shí)間長(zhǎng)，易褪色。但次甲基藍(lán)易得到，溶解性 能好，所以較常用。 吖啶橙：染色效果不太理想，本底顏色深，不易脫掉，但能區(qū)別單鏈或雙鏈核酸(DN A，RNA)，對(duì)雙鏈核酸顯綠色熒光(530nm)，對(duì)單鏈核酸顯紅色熒光(640nm)。,核酸的染色 RNA染色法 熒光染料溴乙錠（簡(jiǎn)稱EB）：可用于觀察瓊 脂糖電泳中的RNA、DNA帶。EB能插入核酸分子中堿基對(duì)之間，使DNA和RNA在紫外燈下顯示較強(qiáng)的熒光。 如將已染色

54、的凝膠浸泡在1mmol/L MgSO溶液中1h，可以降低未結(jié)合的EB引起的背景熒光，對(duì)檢測(cè)極少量的DNA有利。 EB染料具有下列優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，凝膠可用1-0.5g/mL的EB染色，染色時(shí)間取決于凝膠濃度，低于1%瓊脂糖的凝膠、染15min即可。多余的EB不干擾在紫外燈下檢測(cè)熒光；染色后不會(huì)使核酸斷裂，因此可將染料直接加到核酸樣品中，以便隨時(shí)用紫外燈追蹤檢查；靈敏度高，對(duì)1ng RNA，DNA均可顯色。 EB染料是一種強(qiáng)烈的誘變劑，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，應(yīng)戴上聚乙烯手套。,核酸的染色 DNA染色法 除了EB染色最常用外，還有以下幾種方法。 甲基綠：一般將0.25%甲基綠溶于0.2mol/L pH4

55、.1的乙酯緩沖液中，用氯仿抽提至無(wú)紫色，將含DNA的凝膠浸入，室溫下染色1h即可顯色，此法適用于檢測(cè)天然DNA。 Feulgen染色：用此法染色前，應(yīng)將凝膠用1mol/L HCl固定，然后用Schiff試劑在室溫下染色，這是組織化學(xué)中鑒定DNA的方法。,第二節(jié) 光學(xué)檢測(cè)技術(shù),基于物質(zhì)光化學(xué)性質(zhì)而建立起來(lái)的分析方法稱之為光化學(xué)分析法。 分為:光譜分析法和非光譜分析法。 光譜光度分析技術(shù)是利用化學(xué)物質(zhì)具有的發(fā)射光、吸收光或散射光的光譜特征來(lái)分析其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和含量的方法，也叫分光光度技術(shù)。,光的互補(bǔ)：藍(lán) 黃,一、紫外可見(jiàn)光分光光度技術(shù) 利用化學(xué)物質(zhì)在紫外、可見(jiàn)光區(qū)的分子吸收光譜，對(duì)物質(zhì)作定性、定量和

56、結(jié)構(gòu)分析的方法。 物質(zhì)的顏色來(lái)自物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收。各種不同的物資都具有其各自的吸收光譜。,當(dāng)某單色光通過(guò)均勻溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度、入射光強(qiáng)度及溶液的厚度成正比，描述其關(guān)系的方程就是比色原理郎伯-比耳定律。 T = I/I0， A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I。 入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，T為透光度。 透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度。 A = KLC A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度。,二、分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)原理,最常用的是可見(jiàn)分光光度計(jì)和紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì),光源,單色器,樣品 吸

57、收池,檢測(cè)器,信號(hào)指示系統(tǒng),五大部份,結(jié)構(gòu)：,（一）光源,光源定義：,指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。,光源種類：,可見(jiàn)光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。,紫外光光度計(jì)常用氫燈作為光源。,（二）單色器,定義：,將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分 光系統(tǒng)或單色器。,種類：,濾光片,棱鏡,光柵,（三）比色杯,又稱為吸收池或比色皿,材料：,常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成,（五）信號(hào)指示系統(tǒng),（四）檢測(cè)器,檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)

58、，并將電信號(hào) 放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。,是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表顯示出來(lái)的 裝置。,三、分光光度計(jì)的操作方法,（一）分光光度計(jì)的基本操作,以721-A型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：,1.開(kāi)721-A分光光度計(jì)的開(kāi)關(guān)，將比色池的蓋子打開(kāi)，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。 2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。 3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。 4.將開(kāi)關(guān)置于T位，打開(kāi)比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0,關(guān)上 比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。 5.將開(kāi)關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.0 6.重復(fù)步驟4和5 7.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光

59、路，測(cè)量溶液的吸光度（A）,721-A分光光度計(jì),（二）分光光度技術(shù)的定量方法,1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法,根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按最小二乘法的原理，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。,方法：,制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：,（1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新 繪制。,（2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。,（3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。,（4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。,2標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法,Cu=(AuCs)/As,己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白， 同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn) 品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：,其中Cu和Au為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn) 管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量 和標(biāo)本管濃度相近。,3其它分析方法,包括差示法