1、實(shí)驗(yàn)四、偽狂犬病抗體檢測(cè)（阻斷ELISA),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA),將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，從而使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解ELISA的原理和類型 掌握阻斷ELISA操作程序,二、實(shí)驗(yàn)原理,抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性； 抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； 酶結(jié)合物催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺判定抗原抗體反應(yīng)的

2、發(fā)生與否。,間接法（Indirect ELISA） 阻斷法（Block ELISA) 雙抗體夾心法（Sandwich ELISA) 競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive ELISA),（1）間接法測(cè)定抗體 A. 將抗原吸附于固相載體表面； B. 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。測(cè)定底物的降解量抗體量。,顯色,間接ELISA,（2）阻斷法測(cè)定抗體 A.將抗原吸附在固相載體表面; B. 先加待檢血清（抗體）, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.再加酶標(biāo)單抗； D. 加底物。,單抗,阻斷ELISA,（3）雙抗體夾心法測(cè)定抗原 A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加待檢抗原，形成

3、抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,（4）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原 A. 抗體吸附在固相載體表面; B. 同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。,酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀 包被緩沖液：0.025M pH9.6碳酸鹽緩沖液 豬偽狂犬病毒（PRV） 抗原 樣品稀釋液： pH7.4 PBS,三、實(shí)驗(yàn)材料,陰性對(duì)照（EP管中，已稀釋） 陽(yáng)性對(duì)照（EP管中，已稀釋） 樣品 待測(cè)豬血清（EP管中，已稀釋） AP標(biāo)記豬PRV單抗 酶標(biāo)單抗（EP管中，已稀釋） 洗滌液：含0.05% Tween 20的0.01

4、M pH7.4 PBS（青瓶）,常用酶及底物,底物緩沖液： pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液 底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺），底物緩沖液，30% H2O2，新鮮配制 終止液,1.抗原處理：,2.抗原包被：,四、實(shí)驗(yàn)方法,3.加待測(cè)血清：,標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100L/孔,1,2,3,4,陰性,待測(cè),陽(yáng)性,待測(cè),4.加單抗：,37，30min,甩干孔內(nèi)液體,以洗滌液（200L/孔）洗滌3次，3min/次,各孔加入酶標(biāo)單抗100L/孔,37，30min,5.顯色：,甩干孔內(nèi)液體,以洗滌液（200L/孔）洗滌3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光顯色，10min,加終止液1滴,6.觀察結(jié)

5、果,取稀釋好的被檢血清2份和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，每孔加入100l，置37溫育30分鐘。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200l，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。 每孔加酶標(biāo)單抗100l，置37溫育30分鐘。 洗板：同步驟2。 顯色與終止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混勻，室溫（18-25 ）避光顯色10分鐘后。 終止：每孔加終止液1滴(50l) （0.25% 氫氟酸），終止反應(yīng)。 10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采用波長(zhǎng)630nm的酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 結(jié)果判定：試驗(yàn)成立的條件是：陰性對(duì)照孔平均OD630值與陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值之差0.4。 S=樣品孔OD630值，N=陰性對(duì)照孔OD630值 如果S/N比值0.6，樣品判定為PRV抗體陽(yáng)性; 如果S/N比值0.7但 0.6，樣品可疑; 如果S/N比值 0.7，樣品判定為PRV抗體陰性。,五、結(jié)果與分析,陰陽(yáng)性對(duì)照樣品的OD630 ? S/N?，被檢血清是陰/陽(yáng)性？ 結(jié)果與預(yù)期的不符，可能的原因是什么？,預(yù)期結(jié)果,陽(yáng)性：無(wú)色 陰性：藍(lán)色,1 2 3 4,陽(yáng)性,陽(yáng)性,陰性,被檢,單抗,被檢,？,？,ELISA前血清樣品37滅活30分鐘。 在ELISA的整個(gè)操作過(guò)程中，洗滌是非常重要步驟，目的在于防止引起非特異性吸附，洗滌時(shí)盡可能除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，用力甩干。 加入底物液后