1、專題一 膠原蛋白的提取,生物化學(xué)實(shí)用技術(shù) 章宇寧 2012.3,膠原蛋白是一種極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動(dòng)物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。 占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%30%，相當(dāng)于體重的6% 至少有19種不同的類型,膠原蛋白概述,一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì) 通常由3 條多肽鏈組成，每條鏈都有左手螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈繞成右手超螺旋。螺旋區(qū)段之外的部分常發(fā)生各種交聯(lián)。 每一條鏈都有若干個(gè)典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-) n 。X、Y 均表示任意的氨基酸,X 通常是脯氨酸(Pro) , Y 通常指羥脯氨酸(Hyp ) 膠原蛋白中缺少Cys和Try,膠原蛋白的組成與結(jié)

2、構(gòu),制造食品 止血，促進(jìn)傷口愈合 作為可吸收的支架材料、縫合材料 作為藥物載體 局部整形,膠原蛋白的應(yīng)用,從膠原蛋白較為豐富的組織（例如皮膚和肌腱）中提取 傳統(tǒng)來(lái)源：豬牛羊皮 新興來(lái)源：魚鱗等 問(wèn)題一：如何從原料中提取蛋白？ 問(wèn)題二：如何從蛋白中分離膠原蛋白？ 問(wèn)題三：如何檢驗(yàn)得到的蛋白是膠原蛋白？,膠原蛋白的提取,稱取新鮮豬皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液對(duì)其進(jìn)行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細(xì)切。將用蒸餾水洗滌后的組織小塊放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎成糊狀（12000r/min），用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）充分洗滌以去除脂質(zhì)及血

3、清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4OC）。,膠原蛋白提取的前處理,第一步：將蛋白與材料分開，使其進(jìn)入溶液中 酸溶 堿溶 鹽溶 酶解,粗分級(jí),注意根據(jù)所要提取的蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的粗分級(jí)方法,提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。 稀酸，例如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在23之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。 利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結(jié)合在一起的脂肪被皂化

4、，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質(zhì)量，取決于處理時(shí)間以及堿的濃度。 酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水,膠原蛋白提取的粗分級(jí),粗分級(jí),第二步：用簡(jiǎn)便且處理量大的方法去除無(wú)機(jī)物等雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液 鹽析 等電點(diǎn)沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法 超濾 如蛋白相互差異較大，也可初步分離目標(biāo)蛋白,可逆沉淀,鹽析法(中性鹽沉淀法)：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。,有機(jī)溶劑沉淀法： 常用與水互溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)所帶

5、凈電荷為零時(shí)，所處溶液的pH 值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)最不穩(wěn)定，溶解度最小。,超濾法,利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對(duì)生物大分子溶液進(jìn)行過(guò)濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過(guò)濾出去，從而達(dá)到脫鹽或濃縮的目的。,細(xì)分級(jí),進(jìn)一步分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì) 透析 超濾 凝膠過(guò)濾/層析/離子交換色譜 密度梯度離心 電泳 等電聚焦,在粗提膠原蛋白溶液中緩慢加入6mol/L NaOH至pH=7，冷凍離心去除沉淀，在上清液中加入NaCl攪拌，4保存過(guò)夜；離心取沉淀，用稀HAc溶解，將溶液裝入透析袋中，用0.1mol/L 的Hac透析1天，再用蒸餾水透析1天。,膠原蛋白的提純,透析

6、法,電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中向電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象 不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶的電荷、等不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度各異，因而可聚集形成不同的條帶，從而達(dá)到分離的目的。,電泳法,電泳法,膠原蛋白的電泳圖,層析法：,離子交換層析法 凝膠過(guò)濾層析法 親和層析法 吸附層析法 分配層析法,離子交換層析法,原理: 根據(jù)離子交換劑與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換，再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即可達(dá)到分離具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的目的。,凝膠過(guò)濾層析法(排阻層析，分子篩層析),原理： 混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內(nèi)部具有大量一定大小的微孔）的層析柱時(shí)，大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移動(dòng)較快，并最先被洗脫出來(lái)；小分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。,親合層析法,親和蛋白 配基,原理：利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專一性配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合的能力（親合力）來(lái)純化生物大分子。,密度梯度(區(qū)帶)