1、1,時間分辨免疫熒光技術(shù),演講人：李超,2015年2月3日,2,主要內(nèi)容,目前有哪些標(biāo)記免疫學(xué)分析方法？ 什么是免疫熒光技術(shù)？ 什么是時間分辨免疫熒光技術(shù)？ 時間分辨免疫熒光技術(shù)的優(yōu)勢是什么？ 時間分辨免疫熒光技術(shù)可應(yīng)用于哪些方面？,3,目前有哪些標(biāo)記免疫學(xué)分析方法？,免疫熒光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶聯(lián)免疫分析 (Engvall, 1971) 膠體金標(biāo)記免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa， 1977) 時間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 電化學(xué)發(fā)光免疫分析(

2、Leland, 1990) 生物芯片(美國Luminex公司, 1997),4,什么是免疫熒光技術(shù)？,基本原理：,免疫熒光技術(shù)是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。 以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。 在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位。,5,什么是時間分辨免疫熒光技術(shù)？,概念：,時間分辨免疫熒光技術(shù)指利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光

3、，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時間分辨熒光儀即可測定熒光強度，從而推測待測物含量。,6,什么是時間分辨免疫熒光技術(shù)？,基本原理：,用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)； 當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點 （特異性強、熒光光譜的Stokes位移、壽命長），用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強度； 根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的,7,什么是時間分辨免疫熒光技術(shù)？,例如：,三價稀土離子包括有銪(Eu)，釤（Sm)，鋱 (Tb) ，鏑 (Dy)

4、等，它們的熒光光譜具有特異性強 Stokes位移大壽命長的特點； 采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)為雙功能螯合試劑，其一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質(zhì)的-NH2 連接； 在中性或接近中性pH 條件下，DTTA 與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放出來并與增強液中的配體螯合進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu3+熒光得以成千萬倍地放大。,Page 8,通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來,9,時間分辨免疫熒光技術(shù)的優(yōu)勢是什么？,精確度上的優(yōu)勢:,放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶聯(lián)免疫

5、（精度：10-9 mol/L） 膠體金標(biāo)記 （精度：10-15mol/L） 化學(xué)發(fā)光（精度：10-15mol/L） 電化學(xué)發(fā)光 （精度：10-17mol/L） 時間分辨熒光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）,10,技術(shù)上的先進(jìn)性,特點,特異性熒光與非特異性熒光分離度高,時間、光譜分辨,發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離度高,零背景、高特異性,解離、增強,熒光性大大提高 穩(wěn)定的熒光螯合物,線性范圍更寬 重復(fù)性更好,標(biāo)記位點,標(biāo)記位點多 對標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響小 無衰變 受環(huán)境影響小,高穩(wěn)定性，高精確度 試劑保存時間長 標(biāo)準(zhǔn)曲線保留時間長,標(biāo)記方法,單、雙標(biāo)記 多標(biāo)記,同

6、一試劑盒可同時測多個項目,11,時間分辨免疫熒光分析相較于化學(xué)發(fā)光的優(yōu)勢,發(fā)光效率 重復(fù)檢測 本底噪聲 靈敏級數(shù) 標(biāo)記物 標(biāo)記位點 標(biāo)準(zhǔn)曲線 多標(biāo)記 科研開發(fā),時間分辨熒光,化學(xué)發(fā)光,95% 可無數(shù)次 零本底 10-18 原子 可達(dá)20個/抗體 穩(wěn)定達(dá)一年以上 最多可達(dá)四標(biāo)記 有,1% 不可重復(fù) 干擾大 10-15 大分子化合物 1個/抗體 穩(wěn)定 2 到 4周 無 無,12,時間分辨熒光和電化學(xué)發(fā)光比較的優(yōu)勢,標(biāo)記物 多標(biāo)記技術(shù) 做科研 試劑種類 試劑價格,Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58種臨床,24種科研 低,釕 無 無 28種臨床, 無科研試劑 高,時間分辨熒光,電化學(xué)發(fā)光,13

7、,時間分辨免疫熒光技術(shù)優(yōu)點總結(jié),零本底、靈敏度高 線性范圍寬 試劑有效期長 標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性好 易于自動化 對環(huán)境及人體沒有任何影響,14,時間分辨免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用,內(nèi)分泌檢測,甲狀腺功能檢測,糖尿病指標(biāo)檢測,生長激素檢測,T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、Ab 、TPO Ab,胰島素、C肽,hGH（生長激素）,意義：,甲狀腺疾病也是目前最常見最多發(fā)一種內(nèi)分泌疾病，以上各項目的聯(lián)合檢測，為臨床醫(yī)生對病患者甲狀腺功能的評價提供更基礎(chǔ)、全面的依據(jù) 用于區(qū)分胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)和用于胰島素瘤的診斷 對診斷肢端肥大癥是一項特異的方法,15

8、,時間分辨免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用,婦產(chǎn)科檢查： hCG 絨毛膜促性腺激素 LH-Spec 黃體生成素(特異性) FSH 促卵泡激素 PRL 催乳素 E2 雌二醇 Testo 睪酮 Prog 孕酮 SHBG 性激素結(jié)合球蛋白,意義：,檢測這些激素的含量對于生殖生理的研究、疾病的診斷、治療、隨訪及計劃生育工作的開展具有重要的意義。,16,腫瘤科檢查： AFP 甲胎蛋白 PSA 前列腺特異抗原 B2-M Beta 2微球蛋白 NSE 神經(jīng)元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原 PSA Free/total 前列腺特異抗原/總量,時間分辨免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用,腫瘤標(biāo)志物是指示體內(nèi)腫瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物質(zhì)。通過測定其存在或含量，對于腫瘤可輔助診斷，分析病情，指導(dǎo)治療，監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后等。,意義：,17,時間分辨免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用,遺傳疾病檢查,產(chǎn)前篩查 新生兒篩查,血液疾病檢查,貧血檢查 白血病分型 免疫細(xì)胞分型 細(xì)胞毒試驗,傳染病檢查,乙肝系列,表面抗原 表面抗體 e抗原 e抗體 核心抗體,意義：,預(yù)防患有嚴(yán)重遺傳性疾病和先