1、A,1,ELISA（Enzymes linked immunosorbent assay）,2020/9/14,A,2,目錄,ELISA原理,ELISA簡介,ELISA實驗步驟,ELISA相關(guān)儀器、試劑,A,3,ELISA簡介,酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡稱ELISA，它是實驗室最常用的檢測方法。酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過所有人造催化劑，ELISA 就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。使用酶去標(biāo)記抗原或抗體以后，既不影響抗原抗體反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。因此ELISA具

2、有準(zhǔn)確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點，適合于大批標(biāo)本的檢測，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領(lǐng)域。,A,4,1.抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持器免疫學(xué)活性。例如：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與聚苯乙烯表面的疏水基團(tuán)能產(chǎn)生互作用而吸附。 2.抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； 3.酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，由此進(jìn)行定性或定量分析。,ELISA基本原理,A,

3、5,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。,ELISA類別,A,6,雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗體-待測抗原-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體原成正比。,雙抗體夾心法,A,7,當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結(jié)合位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。,競爭法,A,8,雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制

4、備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。,雙抗原夾心法,A,9,間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,間接法,A,10,除了以上常見的4種檢測方法外，還有直接法、捕獲包被法、競爭法（測抗體）、雙抗原夾心法、ABS-ELISA法等其他方法。,A,11,ELISA實驗過程主要分以下三步：,第一：實驗設(shè)計 1.了解將要測定的樣品屬于什么類別，選用最佳的ELISA檢測方法； 2.選用正確的陰性對照品、陽性對照品、樣品標(biāo)準(zhǔn)品等； 3.規(guī)劃實驗中所使用各種試劑的濃度、加入量、反應(yīng)

5、時間等； 4.再細(xì)化實驗中每個步驟的開展時間，合理的時間安排能使實驗有條不絮的進(jìn)行。 第二：實驗準(zhǔn)備 1.實驗所使用物料的清點； 2.實驗試劑的配備； 3.實驗儀器的預(yù)約；,A,12,第三：實驗操作（以雙抗體夾心法為例） 1.包被（在聚苯乙烯板上包被特異性已知抗體，使之與板結(jié)合） 4過夜（大于12小時）或37孵育2小時，包被后洗滌一次； 2.封閉（一般使用0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清等）37反應(yīng)2小時（封閉液體積要大于包被液體積），封閉后清洗3次； 3.加入含有待測抗原的樣品，37孵育1小時； 4.洗滌，清洗3次； 5.加入酶標(biāo)液（酶標(biāo)二抗），37孵育1小時； 6.

6、洗滌，清洗5次； 7.加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)（37避光顯色515min)，終止顯色后測量450/630nm吸光值。 注：上面實驗共12次清洗，清洗次數(shù)可適當(dāng)增多，同一反應(yīng)盡量保證使用同一種清洗液，常見清洗液有PBST、TBST、PBS等。,A,13,結(jié)果判定,定性測定 定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。 待測孔（

7、P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對照孔。 定量測定,A,14,實驗中使用的試劑、儀器,常用試劑： 1.包被緩沖液：0.05M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、0.1M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH78的Tris-HCL 緩沖液等。 2.封閉液：0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。 3.洗滌液：PBS、PBST、TBST等。 4.抗體稀釋液：PBST、0.52%BSA（溶于PBST中）等。 5.底物緩沖液：TMB顯色液、OPD顯色液、ABTS顯色液、AP顯色液等，根據(jù)所使用的酶標(biāo)抗

8、體選用對應(yīng)的底物緩沖液顯色。 6.終止液：2M硫酸。,A,15,常見儀器,單孔道、多孔道移液器,振蕩器,洗板機(jī),酶標(biāo)儀,計時器,A,16,實驗中遇到常見問題與解決方法,1.陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果： 造成該現(xiàn)象的原因有4個： 1）試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現(xiàn)交叉污染。 應(yīng)當(dāng)更換使用試劑，小心操作； 2）酶標(biāo)板洗板不徹底。 嘗試用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈； 3）抗體量過多導(dǎo)致非特異結(jié)合。 應(yīng)該根據(jù)推薦用量使用抗體，盡量使用較少的抗體； 4）夾心法、捕獲法中檢測抗體與包被抗體/抗原反應(yīng)。 確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，兩者之間不會互相

9、反應(yīng)。,A,17,2.酶標(biāo)板整體背景高 造成該現(xiàn)象的原因有4個： 1）抗體非特異性結(jié)合。 應(yīng)確保進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液，最好使用5%10%的與二抗同種動物來源的血清或牛血清，確保板孔經(jīng)過預(yù)處理以防止非特異結(jié)合，使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，最好經(jīng)過了預(yù)吸收處理； 2）底物結(jié)合濃度過高或反應(yīng)時間過長。 應(yīng)調(diào)整底物的濃度，當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時間； 3）底物溶液不新鮮或被污染。 應(yīng)檢測底物溶液，正常的底物溶液應(yīng)該是清亮透明的，如果變黃或其他顏色則是被污染的標(biāo)志； 4）底物孵育過程沒有避光。 底物孵育應(yīng)該在避光環(huán)境下進(jìn)行。,A,18,3.吸光

10、度數(shù)值偏高或偏低 造成的該現(xiàn)象的原因有幾個： 1）樣品中待檢抗原含量太低會導(dǎo)致測試結(jié)果偏低。 可嘗試增加樣品的使用量或者更換一個檢測更靈敏的方法； 2）加入抗體量不合適也會造成結(jié)果偏低或偏高 應(yīng)確定使用的是建議抗體用量，或者為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量； 3）孵育時間不夠長會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。 應(yīng)適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合； 4）孵育溫度不適合。 應(yīng)保證抗體在最適宜并且穩(wěn)定的溫度下孵育，一般是室溫（25孵育2h或37孵育1h）。,A,19,影響因素的分析,1.標(biāo)本的影響 1.1 溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性 可能是溶血

11、血清中含有過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽性。所以嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。 1.2 標(biāo)本受細(xì)菌污染 ：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。 1.3 標(biāo)本保存不當(dāng) ：在冰箱中保存過久的標(biāo)本，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5 d內(nèi)測定的血清標(biāo)本可存放于4，1周后測定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融

12、解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。,A,20,1.4 塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。 1.5 標(biāo)本凝固不全 在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。 2.試劑影響 ELISA檢測

13、試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之。 3.操作技術(shù)的影響 3.1 吸量的準(zhǔn)確性 :吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。,A,21,3.2 溫浴影響 :抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。 3.3 加樣次序影響 :有時我們在加樣過程中，常常會遇到個別標(biāo)本未離心等情況，為了節(jié)約時間，往往這時我

14、們會先加酶結(jié)合物，然后等標(biāo)本分離好后再加標(biāo)本，這樣，竟常常會造成HBeAb和HBcAb的假陰性。因為HBeAb和HBcAb都是競爭抑制法，先加入酶標(biāo)記的抗體，首先與固相載體上的抗原結(jié)合，待加入顯色劑后，因酶的存在而顯色，故呈陰性。 3.4 洗滌方法對結(jié)果的影響 :洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，全自動洗板機(jī)使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過程中要不時觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，洗板機(jī)不用時應(yīng)用去離子水清洗幾遍。,A,22,4.干擾物質(zhì)的影響 4.1有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過