1、1,噬菌體及其應(yīng)用,2,Contents,噬菌體簡介,1,噬菌體應(yīng)用技術(shù)簡介,2,噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用,3,前景及展望,4,3,1、噬菌體簡介,概念：噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、立克次體及放線菌等微生物的病毒,屬非細(xì)胞微生物。 特性： 個(gè)體微小，需用電鏡觀察， 可以通過細(xì)菌濾器； 沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)組成； 專性活細(xì)胞內(nèi)寄生,具有嚴(yán)格的寄生特異性。,4,形態(tài)與結(jié)構(gòu),形態(tài)：蝌蚪形，微球形，細(xì)桿形,5,噬菌體顆粒在結(jié)構(gòu)上有很大差別，一般可分成三種類型，即 無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體，有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體和線狀體，迄今已知的噬菌體大多數(shù)是有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體。,頭部,尾部,6

2、,核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，某些噬菌體基因組中還含有異常堿基。 大多數(shù)為線狀雙鏈 DNA噬菌體 少數(shù)為環(huán)狀單鏈 多數(shù)為線狀單鏈 RNA噬菌體 少數(shù)為線狀雙鏈,7,8,化學(xué)組成,核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，某些噬菌體基因組中還含有異常堿基。 大多數(shù)為線狀雙鏈 DNA噬菌體 少數(shù)為環(huán)狀單鏈 多數(shù)為線狀單鏈 RNA噬菌體 少數(shù)為線狀雙鏈,9,10,按與宿主的相互關(guān)系，噬菌體可以分為兩種類型： 烈性噬菌體，溫和噬菌體（溶原性噬菌體） 烈性噬菌體:能在宿主菌內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。 溫和噬菌體（溶原性噬菌體）：噬菌體基因組整合于宿主菌

3、染色體中，不產(chǎn)生子代噬菌體，也不引起細(xì)菌裂解，但噬菌體DNA隨細(xì)菌基因組的復(fù)制而復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而分配至子代細(xì)菌的基因組中。,11,吸附,穿入,生物合成,裝配,釋放,烈性噬菌體的溶菌周期,12,2、噬菌體的應(yīng)用技術(shù),應(yīng)用,鑒定細(xì)菌分型,測定輻射劑量,檢測基因 產(chǎn)物的活性,篩選目的基因,檢測病原菌,預(yù)防和治療 傳染性疾病,13,3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用,食源性疾病病原的檢測技術(shù) 作為食品添加劑 噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素,14,3.1食源性疾病病原的檢測技術(shù),食源性疾病病原的檢測技術(shù)是食源性疾病的預(yù)防與控制的關(guān)健的技術(shù)環(huán)節(jié)。數(shù)據(jù)顯示，每年大約有7600 萬人因食用了受污染的食物而患病，其

4、中91% 是由于細(xì)菌污染造成。 現(xiàn)存的檢測方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、生物芯片技術(shù)和免疫學(xué)方法等。 缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)力、價(jià)格昂貴、特異性或靈敏度低、國內(nèi)試劑供應(yīng)不配套等，很難適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)的需要。 有必要尋找一種簡捷、快速、靈敏度高的檢測食源性病原微生物的方法以及技術(shù)平臺。,15,檢測方法,16,3.1.1噬菌斑檢測,原理：用噬菌體截獲某種病原菌，隨后病原菌被噬菌體感染，用殺毒劑將胞外的剩余噬菌體殺死，然后將噬菌體與被感染細(xì)胞混合并在裝有軟瓊脂的雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)，被感染的細(xì)胞破裂釋放出子代噬菌休，在培養(yǎng)基中就會(huì)形成空斑。,17,實(shí)驗(yàn)方法,標(biāo)本采集后置

5、于SC 增菌管中37 增菌18 h左右, SS 平板分離培養(yǎng)37 過夜, 然后挑出具有沙門氏菌特征的單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂平皿上, 每塊平板劃格后可接種8 個(gè)菌落左右。 在每格中央用滅菌的毛細(xì)滴管滴上O-I噬菌體, 待溶液干后置37 6-8 h 培養(yǎng)或過夜, 觀察噬菌體裂解情況。 發(fā)現(xiàn)被O-I 噬菌體裂解的菌株, 馬上挑取噬斑周圍菌苔直接做沙門氏菌A- F 多價(jià)血清凝集試驗(yàn), 凝集陽性者即可初步報(bào)告結(jié)果, 然后轉(zhuǎn)種克氏雙糖鐵管作進(jìn)一步鑒定分型。,18,簡例,O-I噬菌體是作用于沙門氏菌屬特異性噬菌體,染色體為雙鏈DNA,受體是宿主細(xì)胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。應(yīng)用O-I噬菌體進(jìn)行飲食行

6、業(yè)及公共場所從業(yè)人員帶菌調(diào)查結(jié)果表明, 沙門氏菌檢出率為0. 131%, 與廣東省報(bào)道的0. 134%檢出率相近, 說明O- I 噬菌體應(yīng)用對沙門氏菌的診斷具有較高的特異性和敏感性, 不失為大量從業(yè)人員沙門氏菌調(diào)查的較為理想快速診斷方法。,19,3.1.2熒光染料標(biāo)記法,原理：選用一種合適的染色劑，噬菌體的核酸染色標(biāo)記，然后用標(biāo)記過的噬菌體侵染相應(yīng)的宿主菌，噬菌體吸附在宿主菌表面后，隨即將標(biāo)記過的核酸注入宿主細(xì)胞，隨著越來越多的噬菌體核酸的注入，細(xì)胞內(nèi)熒光隨著熒光素的增多而增強(qiáng)，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測。,20,簡介,A圖只有細(xì)菌,熒光視野里不見任何發(fā)光物質(zhì);B

7、圖中只有熒光標(biāo)記O-I噬菌體,視野下偶爾可見少量圓點(diǎn)狀的熒光物質(zhì),不見菌形;C圖是熒光標(biāo)記O-I噬菌體和沙門氏菌混合,可見大量桿狀物,少量點(diǎn)狀物,極少數(shù)彗星狀桿狀物,將桿狀物質(zhì)與沙門氏菌的革蘭氏染色形態(tài)進(jìn)行比較,兩者一致。 由此可推知,C圖中桿形物是侵有熒光噬菌體的沙門氏菌,點(diǎn)狀物是標(biāo)記的O-I噬菌體,結(jié)合B圖可知彗星狀桿形物是即將裂解的宿主菌。,21,簡例,蔣魯巖等用此方法快速檢測食品源沙門氏菌，檢測靈敏度達(dá)10 CFU/100L;120份食品樣品中沙門氏菌的O-I噬菌體檢測與生化鑒定結(jié)果的陽性率分別為9.17%和10%,符合率為91.7%。表明用熒光標(biāo)記的O-I噬菌體可以快速、直觀、準(zhǔn)確、

8、大量地檢測食品中沙門氏菌。,22,3.1.3報(bào)告基因檢測技術(shù),該技術(shù)中，將一個(gè)報(bào)告基因通過噬菌體插入到目標(biāo)菌體的D N A 中，隨著報(bào)告基因的表達(dá)，目標(biāo)菌體便可快速得到檢測。 應(yīng)用在這一技術(shù)的報(bào)告系統(tǒng)主要有原核生物和真核生物的熒光素酶(lux,luc)基因，細(xì)菌冰核蛋白(inaW)基因，E.coli- 半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素親和蛋白。報(bào)告噬菌體已經(jīng)能夠成功檢測許多菌種，如E.coli,Salmonella.spp 等 。,23,簡介,24,利用熒光素酶基因作為報(bào)告基因的快速檢測技術(shù),對于細(xì)菌來說，發(fā)光機(jī)理可用下式表述： F M N H 2+ R C H O + O 2 F M N

9、+ H 2O + R C O O H + h (490nm) 反應(yīng)是在熒光素酶的催化下進(jìn)行的。細(xì)菌的熒光素酶是一個(gè)7 7 k D 的二聚體，其中包含亞基( 4 0 3 7 k D ) 和亞基(37kD)。 目前，生物發(fā)光基因(lux,luc)在報(bào)告噬菌體檢測技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛。 Waddell 等利用轉(zhuǎn)座子致突變，將lucA和lucB基因插入到E.coli O157:H7的溫和噬菌體 V 1 0 中，構(gòu)建了一個(gè)熒光素酶轉(zhuǎn)座噬菌體，這一噬菌體能夠使E.coli O157:H7 在1h 內(nèi)被成功檢測，并報(bào)告出結(jié)果。,Masahito等將綠熒光蛋白(GFP)基因分別插入到T偶數(shù)型噬菌體PP01 的外

10、殼蛋白(SOC)基因的C 末端和N 末端，構(gòu)建成噬菌體PP01-GFP/SOC 和PP01-SOC/GFP，這種對E.coli O157:H7特異的噬菌體能夠成功檢測菌體的可培養(yǎng)細(xì)胞，不可培養(yǎng)但可存活細(xì)胞(VBNC)及經(jīng)過巴氏消毒過的細(xì)胞，靈敏度高，檢測時(shí)間僅為20min。,25,以- 半乳糖苷酶作為報(bào)告基因的快速檢測技術(shù),-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是一種催化-半乳糖苷水解反應(yīng)的糖苷酶。 -半乳糖苷酶的作用特性是隨著水解反應(yīng)底物的不同而改變，鄰硝基苯-D- 半乳糖苷是檢測中常用的靈敏基質(zhì)，它被- 半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，該技術(shù)可以使檢測的靈敏度達(dá)到生物發(fā)光熒光素酶檢測的水平。

11、 Goodridge等設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有l(wèi)acZ基因的T4噬菌體，用這種噬菌體感染待測樣品，并用化學(xué)發(fā)光基質(zhì)作為檢測基質(zhì)，研究人員成功檢測了肉湯培養(yǎng)基中的E.coli，檢測限僅為102CFU/ml。然后，研究人員將最大概率數(shù)(most probable number，MPN)法應(yīng)用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可降至10CFU/ml，用時(shí)僅1h。,26,3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用,食源性疾病病原的檢測技術(shù) 作為食品添加劑 噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素,27,3.2作為食品添加劑,美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)了一種由噬菌體病毒混合而成的產(chǎn)品，主要用于殺滅肉制品中的李氏桿菌。這是美國首次批準(zhǔn)將病毒用作食品

12、添加劑。 美藥管局專家稱，該產(chǎn)品在制備過程中可能留有殘毒，但試驗(yàn)表明，這些微量的殘毒不會(huì)引起任何健康問題。該產(chǎn)品包含6種噬菌體病毒，可在熟肉片和香腸等包裝前噴灑在這些肉制品上，有效殺滅多種李氏桿菌，預(yù)防由這些細(xì)菌引起的食物中毒。產(chǎn)品中所包含的噬菌體只會(huì)攻擊李氏桿菌，對人體和植物細(xì)胞都不會(huì)產(chǎn)生影響。,28,3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用,食源性疾病病原的檢測技術(shù) 作為食品添加劑 噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素,29,3.3 噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素,噬菌體展示技術(shù)(Phage display technology)是20 世紀(jì)80 年代逐步建立并發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。它以噬菌體或噬粒為載體

13、, 使外源肽或蛋白基因與噬菌體表面特定蛋白基因在其表面進(jìn)行融合表達(dá), 進(jìn)而通過親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體。,30,真菌毒素作為天然毒素廣泛存在于谷物等食品中，世界很多國家均有被污染的報(bào)告，由于真菌毒素屬于痕量污染物，因此檢測技術(shù)主要有各類色譜法和利用抗體的免疫學(xué)方法。 其中高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度和可靠性都很高 缺點(diǎn)：樣品處理繁瑣，儀器昂貴，現(xiàn)場快速檢測中難以普及使用 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA) 優(yōu)點(diǎn)：可以同時(shí)大批量檢測樣品，攜帶方便，操作簡便和經(jīng)濟(jì), 常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化 缺點(diǎn):目前用于ELISA 檢測試劑盒

14、的各類毒素的單克隆抗體(McAb) 主要來源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，在篩選單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個(gè)長期復(fù)雜的過程，既耗費(fèi)財(cái)力、物力，又浪費(fèi)時(shí)間，且檢測所用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴。,31,利用噬菌體展示技術(shù)制備抗體、模擬抗原表位，不僅繞過了細(xì)胞融合，而且可以以單克隆抗體（McAb） 或單鏈抗體（ ScFv）為靶分子篩選真菌毒素的模擬抗原表位，代替真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，建立無毒ELISA檢測方法，保證實(shí)驗(yàn)操作人員和相關(guān)研究人員的人身安全。 熊嘯（2007 年）等選用抗黃曲霉毒素M1（anti-AFM1,Aflatoxin M1,AFM1）單克隆抗體為篩選配基，從噬菌體表面展示的隨機(jī)7 肽庫中篩選出AFM1 抗原的模擬表位LTSFPRH 和MAPSSWR，為研制出安全無毒的ELISA 試劑盒奠定基礎(chǔ)。,32,4、前景及展望,噬菌體檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確而直觀