1、實(shí)驗(yàn)二十五 真核基因組DNA分離純化 外周血白細(xì)胞提取DNA（NaI法）,實(shí)驗(yàn)二十五 NaI法提取外周血白細(xì)胞 DNA 學(xué)時數(shù)：3 教學(xué)目的:掌握NaI法提取外周血白細(xì)胞DNA的原理和方法。 教學(xué)重點(diǎn):實(shí)驗(yàn)原理與過程 教學(xué)難點(diǎn):實(shí)驗(yàn)原理與方法 使用教具:多媒體 教學(xué)方法:互動式、討論式教學(xué)法 講授內(nèi)容綱要、要求及時間分配 導(dǎo)入：（用一部著名電影導(dǎo)入正題，激發(fā)學(xué)生探索生命奧秘的興趣） 12 min 交代正題： NaI法提取外周血白細(xì)胞DNA 1 min （一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ê喢鞫笠?1 min （二）實(shí)驗(yàn)原理（提出問題，學(xué)生閱讀，在問題中理解實(shí)驗(yàn)原理） 1214 min （三）實(shí)驗(yàn)材料 3 min

2、 （四）實(shí)驗(yàn)步驟（思路清晰，結(jié)合原理講解） 1516 min （五）注意事項(xiàng) 2 min （六）實(shí)驗(yàn)報告 1 min,引言：1min 美國好萊塢電影侏羅紀(jì)公園總票房超過3億美元同時也創(chuàng)造了一種大膽的科學(xué)設(shè)想：一只蚊子吸取了恐龍的血液，蚊子恰巧又被琥珀完美保存至今日，科學(xué)家因此獲取了恐龍的DNA，再現(xiàn)了恐龍時代。,真核基因組DNA的分離純化,回憶理論知識 1.真核生物的核酸類型和分布 2.真核生物DNA的結(jié)構(gòu),核酸的分離純化,（一）原則：保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整；排除蛋白質(zhì)、脂類、多糖等其他分子的污染；無其他核酸分子的污染。,（二）步驟：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，

3、去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除鹽、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，最后得到純化的核酸。,NaI法提取外周血白細(xì)胞DNA,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誑aI法提取外周血白細(xì)胞DNA的原理和方法。,用NaI法提取白細(xì)胞中的DNA可用于Southern雜交、PCR等。 例如做親子鑒定可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。,1.NaI起什么作用？ 2.如何將DNA從蛋白質(zhì)中釋放出來？,思考：,實(shí)驗(yàn)原理：從全血制備白細(xì)胞DNA，可用雙蒸水溶脹紅細(xì)胞及白細(xì)胞膜，釋放出血紅蛋白及細(xì)胞核，使核酸處于易提取狀態(tài)，加NaI破核膜并使DNA從核蛋白中解離，用氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全，DNA

4、存在于上層水相中，以異丙醇沉淀DNA，離心棄去異丙醇，并重復(fù)操作一次，即可獲得白細(xì)胞DNA。,實(shí)驗(yàn)材料,1.器材 （1）高速冷凍離心機(jī)。 （2）自動移液器。 （3）槍頭、1.5ml離心管（高壓滅菌） 2.試劑 （1）6mol/LNaI (2)氯仿/異戊醇（24:1V/V） (3)純異丙醇（AR） （4）37%異丙醇 （5）雙蒸水（高壓滅菌） （6）TE緩沖液（PH8.0）高壓滅菌,1.取消毒EP管，做好標(biāo)記，取外周抗凝血（全血）100ul于EP管中，以10000rpm離心1min 。 2.棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s。（破紅細(xì)胞、白細(xì)胞膜） 3.混勻后加6M NaI溶液200ul

5、，緩慢搖勻20s。（破核膜,使DNA從核蛋白中解離） 4.加入氯仿/異戊醇（241）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。,實(shí)驗(yàn)步驟,（思考：每個步驟的作用？）,7.棄37異丙醇，敞開EP管蓋,倒扣在濾紙上將37異丙醇吸干,或放在超凈臺上吹干，加1xTE溶液30ul，溶解DNA12h以上，制成的DNA液以瓊脂糖凝膠電泳鑒定或-20冰箱保存。,5.取上層液360ul，加入另一新EP管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應(yīng)體系14000rpm離心12min，使沉淀緊貼EP管壁。 6.棄異丙醇，加37異丙醇1ml（不振動），以14000rpm離心12min。,2.混勻試劑、吸取上清等操作時避免動作劇烈。 3.棄異丙醇時動作應(yīng)輕，切忌甩干，以免DNA丟失。 4.DNA沉淀中的異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。,注意事項(xiàng)： 1.標(biāo)本必須新鮮，提取前細(xì)胞應(yīng)保持完整。所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、試劑等應(yīng)高壓滅菌，操作盡量在4以下進(jìn)行。,實(shí)驗(yàn)題目 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)過程及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)