1、CELLECTIS S.A. NASDAQ,DNA剪切技術(shù)治療1歲女童獲成功,基因組編輯技術(shù)簡(jiǎn)介 Genome Editing,2015.11.22 HuangCH J208,修改遺傳信息的第一步： 按我們的設(shè)計(jì)來(lái)重組DNA,第一節(jié) 基 本 概 念,重組DNA技術(shù)： 是指在基因水平上，將目的DNA在體外重組于能自我復(fù)制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增生，以獲得大量的目的DNA片段，或以此為基礎(chǔ)，通過(guò)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過(guò)程。 又稱為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù),第二節(jié) 重組DNA技術(shù)的發(fā)展史,基因工程的誕生,1、Berg的開(kāi)創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組

2、,1980年Nobel化學(xué)獎(jiǎng),猴病毒SV40的DNA+噬菌體的DNA,2、Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)第一個(gè)取得基因工程成功,1973年構(gòu)建雙重抗藥性重組質(zhì)粒 1973年是基因工程誕生的元年,第三節(jié) 工具酶,Werner Arber 理論預(yù)見(jiàn)限制酶,Hamilton O. Smith 得到第一個(gè)限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片斷,1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),1、 “基因剪刀”限制性核酸內(nèi)切酶,1.定義：能識(shí)別雙鏈DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在識(shí)別序列內(nèi)或附近切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的一類(lèi)核 酸內(nèi)切酶（在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶）。,2.來(lái)源：原核生

3、物,型酶、型酶： 具有限制切割與甲基化修飾活性。型和型酶都沒(méi)有多大的實(shí)用價(jià)值。,型酶： 應(yīng)用廣泛，能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)，識(shí)別和切割雙鏈DNA，其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。 通常所說(shuō)的限制性內(nèi)切酶就是指型酶。,3.分類(lèi)：根據(jù)結(jié)構(gòu)、作用特點(diǎn)不同，分為三類(lèi)。,識(shí)別位點(diǎn)：即為型酶識(shí)別的特殊DNA序列。,通常是48個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列的DNA片段,5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5,4.識(shí)別和切割位點(diǎn)：, 5突出粘性末端 3突出粘性末端 平頭（鈍性末端）,5突出黏性末端(EcoR)：,3突出黏性末端(Pst)：,平端缺口（鈍性末端）( Sma）,切割方式：對(duì)

4、dsDNA 2條鏈同時(shí)切割產(chǎn)生3種不同缺口,2、DNA連接酶,催化DNA中相鄰的5端磷酸基和3-OH末端之間形成35磷酸二酯鍵。 大腸桿菌連接酶，只能連接粘性末端，T4噬菌體連接酶不但能連接粘性末端， 還能連接齊平末端。,3、DNA聚合酶,具有53聚合活性、53外切酶活性、35外切酶活性。 可用于合成雙鏈cDNA分子或片斷連接，探針制備，序列分析等。,耐熱DNA聚合酶 最適反應(yīng)溫度為7580 具有53外切酶活性，不具有35外切酶活性,（1）5端標(biāo)記 （2）制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身 連接，提高重組效率。 堿性磷酸酶有細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸 酶（CIP）。C

5、IP能在 1% SDS溶液中68 加熱15 min而 失活，故CIP較為常用。,4、堿性磷酸酶,去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5端的磷酸根。,催化單脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA3-端羥基上。 應(yīng)用：探針標(biāo)記，標(biāo)記測(cè)序以及制備人工黏性末端。,催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化。 用途：放射性標(biāo)記DNA的5端 使缺少5-磷酸基的DNA磷酸化用于連接反應(yīng)。,單鏈核酸內(nèi)切酶，降解單鏈DNA或RNA。,6、T4多聚核苷酸激酶,7、S1核酸酶,5、末端轉(zhuǎn)移酶,第四節(jié) 重組DNA技術(shù)常用載體,是指能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一類(lèi)DNA分子。,一、定義,分類(lèi)： 克隆載體：用于在宿主細(xì)胞中克隆和擴(kuò)增

6、外 源DNA片段。 表達(dá)載體：用于在宿主細(xì)胞中獲得外源基因 表達(dá)產(chǎn)物。,1、具備復(fù)制能力。 2、具備一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)志。 3、具備較多拷貝數(shù)，易從宿主細(xì)胞中分離純化。 4、具備一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別點(diǎn)（多克隆位 點(diǎn)，MCS）。 5、具有較高的遺傳穩(wěn)定性。,二、特點(diǎn),這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能：如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。,3、常用載體,質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA、酵母DNA,1、質(zhì)粒（plasmid）:,質(zhì)粒為細(xì)菌染色體之外一些能獨(dú)立復(fù)制并保持穩(wěn)定遺傳的復(fù)制子。結(jié)構(gòu)上，它是一種雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子。,pBR322質(zhì)粒載體

7、 相對(duì)分子質(zhì)量小，長(zhǎng)度為4.3kb。 含有氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因(Ampr和Tetr)。 有24種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（ori）及與DNA復(fù)制有關(guān)的序列，賦予該質(zhì)粒復(fù)制子特性。 為松弛型復(fù)制子。,是感染細(xì)菌的一類(lèi)病毒，寄生于細(xì)菌中，并能溶解細(xì)菌細(xì)胞，故稱噬菌體。,2、噬菌體（bacteriophage,phage),噬菌體生活周期,4、病毒,3、酵母 酵母人工染色體（YAC）：用于大片段DNA的克隆。,第五節(jié) 重組DNA技術(shù),基本步驟,目的基因的獲取,重組DNA導(dǎo)入受體菌,目的基因與載體 連接成重組DNA,克隆載體的選擇,重組體的篩選,克隆基因的表達(dá),1、 制備目的基因,

8、（1）化學(xué)合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根據(jù)基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)基因DNA堿基序列。 目前使用DNA合成儀合成的片段長(zhǎng)度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，較長(zhǎng)的鏈則須分段合成，然后用連接酶加以連接。,（2）構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)：,將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基 因組DNA用物理或酶學(xué)的方法 切割成預(yù)期大小的片斷，并將 所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體 連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中 保存和擴(kuò)增。 理論上講，這些重組載體 上帶有了該生物體的全部基 因，稱為基因文庫(kù)。,(3)構(gòu)建cDNA文庫(kù)：,(5)直接用限制性內(nèi)切酶切取、分離： 對(duì)一些物理圖譜已經(jīng)確定，背景資料清楚的原核生物、噬菌體及病毒等基

9、因組，可直接用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)分離獲得目的基因。,(4)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR從基因組DNA中獲得目的基因，或用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。,2、克隆載體的選擇和構(gòu)建,用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的噬菌體和黏性質(zhì)粒； cDNA文庫(kù)和克隆較小DNA片段通常選pUC系列質(zhì)粒； 待測(cè)DNA序列使用M13噬菌體。,由同一種限制酶切割或不同的限制酶切割形成互補(bǔ)的黏性末端。經(jīng)退火后，由DNA連接酶連接。,3、目的基因與載體的連接,粘性末端連接：,平端 DNA片段可以在T4 DNA連接酶的作用 下相連接，但連接效率較低。為提高連

10、接效率, 所用的ATP及T4 DNA連接酶的濃度比粘性末端 連接要高些。,（2）平端連接：,（3）定向連接：,（4）同聚物加尾連接：,（5）人工接頭連接：,接頭是指含有某些限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的寡核苷酸片段。,4、重組DNA導(dǎo)入受菌體,將重組DNA或其他外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法： 轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔等。,轉(zhuǎn)化（transformation）：是指將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。,轉(zhuǎn)染（transfection）：將重組噬菌體DNA直接引入受體細(xì)胞的過(guò)程。,轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：重組噬菌體DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包 裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為載體，將

11、 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程，也稱為感染（infection）。,5、重組體的篩選與鑒定,篩選是指通過(guò)某些特定方法，從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中，鑒別出真正的陽(yáng)性重組子的過(guò)程。,（一）根據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法 （1）抗生素抗性篩選 （2）-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 （二）根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法,方法：,（1）抗生素抗性篩選: 大多數(shù)載體均帶有抗生素抗性基因,（一）根據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法,b.插入失活法:外源基因插入到一個(gè)抗性基因位點(diǎn)，使 此種抗生素抗性消失，重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能在含有 這種抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。,a.構(gòu)建重組體時(shí)，保留了抗性基因活性，所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 就能在含此種抗

12、生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 則不能生長(zhǎng)。,(插入失活法) 抗生素抗性篩選,（2） -半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選,（二）根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法,（1）快速裂解菌落并鑒定分子大小 （2）內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定 （3）分子雜交 （4）PCR （5）核酸序列測(cè)定,（1）分離：提取和獲得目的基因和載體 （2）切割：分別對(duì)目的基因和載體DNA 酶切； （3）連接：目的基因與載體連接，形成 新的重組 DNA分子； （4）轉(zhuǎn)化：用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì) 胞； （5）篩選：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆 （6）表達(dá)：培養(yǎng)獲得外源基因的細(xì)胞或 生物體，獲得所需的遺傳性 狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。,小結(jié)：,修改遺傳信息

13、的第二步： 怎樣將需要的信息導(dǎo)入到細(xì)胞？,重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化微生物,化學(xué)轉(zhuǎn)化法 電轉(zhuǎn)化法 基因槍轉(zhuǎn)化法,電轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn) 適用微生物多 效率高 死亡率高,化學(xué)轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn) 適用微生物較少 效率較高,基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn) 適用微生物較少 效率較高,革蘭氏陽(yáng)性菌的轉(zhuǎn)化 一般需要制備原生質(zhì)體,真菌的轉(zhuǎn)化 一般需要制備原生質(zhì)體,植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù),根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因,圖10-1 農(nóng)桿菌侵染傷口的模式圖,基因槍介導(dǎo)法 電轉(zhuǎn)化法 PEG轉(zhuǎn)化法 花粉管通道法,動(dòng)物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù),原核顯微注射法 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 病毒載體法,1980年代初，ES細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)成功奠定了基因重組/敲除的技術(shù)基礎(chǔ)

14、 1985年首次證實(shí)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因重組/敲除的理論基礎(chǔ) 1987年，Thompsson et al首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型 在隨后的時(shí)間里基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步發(fā)展和完善,基因重組/敲除的概念及簡(jiǎn)史,基因敲除的原理,基因突變,RNAi,同源重組,RNAi引起基因敲除的機(jī)制,同源重組進(jìn)行的基因敲除是通常意義上的基因敲除 適用范圍：適用的細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞; 原理(應(yīng)用DNA同源重組原理)：通過(guò)外源載體和內(nèi)源靶位點(diǎn)相同的核苷酸序列之間的同源重組,使外源DNA定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞的特定的基因座上,同源重組引起的基因敲除,單交換,雙交換,圖

15、1,圖2,同 源 重 組 原 理 圖 示,構(gòu)建與靶基因同源 (1015kb)的載體,外顯子插有新霉素抗性基因 （neor）作為正選擇,皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作為負(fù)選擇,neor 和HSV-tk作雙重篩選 存活的ES細(xì)胞,將重組體導(dǎo)入ES細(xì)胞，體外培養(yǎng),顯微注射,回交得到X被敲除的動(dòng)物,表型分析,同源重組引起的基因敲除ES細(xì)胞,技 術(shù) 路 線,圖 示,ZFN 技術(shù)原理,鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。,鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè)螺旋可以特異識(shí)別3-4個(gè)堿基； 人工設(shè)計(jì)

16、識(shí)別特異DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通過(guò)改變其中7個(gè)X來(lái)實(shí)現(xiàn)識(shí)別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列； 構(gòu)建成對(duì)人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。,ZFN 技術(shù),鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除,研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫(kù)，識(shí)別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識(shí)別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。,嶄新的技術(shù) - TALEN 經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體DNA序列的人工編輯修改 （點(diǎn)）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout）

17、片段刪除 片段插入 目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療,嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn),靶向基因技術(shù),經(jīng)典方法 ： 自殺質(zhì)粒，同源重組 幾率低(1 HR event per 106 cells），難！ 飽含希望與失望的技術(shù)： ZFN，被Sigma公司壟斷 新的里程碑： TALEN,TALEN技術(shù),基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚(yú)與大鼠等各類(lèi)研究對(duì)象。 技術(shù)原理： 表達(dá)一個(gè)重組核酸酶，在靶點(diǎn)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識(shí)別靶點(diǎn)核酸序

18、列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過(guò)程。,1989年 植物病原體黃單胞菌屬 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 2007年 發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性， avrBs3 TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列與核酸靶序列的對(duì)應(yīng)關(guān)系被破譯 由34個(gè)aa組成一個(gè)單元模塊，重復(fù)17 -18次 34個(gè)aa中的第12和13個(gè)氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 對(duì)應(yīng)識(shí)別一個(gè)目標(biāo)堿基,TALEN 發(fā)展過(guò)程,人工構(gòu)建TALE模塊識(shí)別指定核酸序列,102堿基模塊單元, 14 18個(gè)重復(fù),真核表達(dá),特異識(shí)別指定

19、的14 -18 個(gè)核酸序列并與之結(jié)合,34氨基酸單元,TALEN 發(fā)展過(guò)程,TALEN (TALE+FOK I) 表達(dá)質(zhì)粒對(duì),TALEN 基因敲除,X 2,TALEN 表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染、表達(dá) 切割靶位點(diǎn),切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過(guò)程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體,TALEN介導(dǎo)的同源重組,同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級(jí),HR,Left arm,Right arm,Left arm,Right arm,點(diǎn)突變,片段刪除,基因敲入,2011年8月， Nature Biotec

20、hnology 上同時(shí)發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一篇人類(lèi)干細(xì)胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚(yú) Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebra

21、fish using customized TALENs 一篇綜述 Move over ZFN,TALEN的最前沿,TALEN靶向（基因敲除）技術(shù)基本流程,選擇、確定靶點(diǎn) 2. TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建 3. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 4. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá)TALEN重組蛋白 5. 檢測(cè)突變效率，篩選（移碼）突變體,X 2,X 2,X 2,靶點(diǎn)的DNA序列特征： 相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn) 參考文獻(xiàn)：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other T

22、AL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件：/node/add/talef-off/,選擇確定TALE靶點(diǎn),TAL的核酸識(shí)別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G，非常簡(jiǎn)單明確 欲使TALEN特異識(shí)別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14 -18個(gè)

23、）串聯(lián)克隆即可。,TALE識(shí)別模塊串聯(lián)構(gòu)建,具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng),具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng),步驟一：靶點(diǎn)識(shí)別單元串聯(lián),步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建,具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng),將靶點(diǎn)識(shí)別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對(duì) 靶點(diǎn)識(shí)別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個(gè)堿基）分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。,X 2,真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對(duì),步驟

24、三. 將TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除 TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合。此時(shí)，兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因。,FOKI 內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū),內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過(guò)程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。,突變體形成,PCR 酶切法 利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 當(dāng)

25、左右靶點(diǎn)之間沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-I核酸酶檢測(cè)。 經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：= 2%可用，=10%很好,TALEN切割效率檢測(cè),TALEN切割效率檢測(cè),啟動(dòng)子 ABCDEF stop-Target site - DEFHIJK,啟動(dòng)子 ABCDEFHIJK,共轉(zhuǎn)染 熒光素酶檢測(cè)質(zhì)粒 + TALEN質(zhì)粒 1 + TALEN質(zhì)粒 2,熒光素酶檢測(cè)法,發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。 有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)1.5至2倍即可有效獲得突變體。,TALE技術(shù)應(yīng)用范圍,細(xì)菌：尚無(wú)報(bào)道，已另有多種高效靶向技術(shù)。 真菌：有報(bào)道，TALE原理可行。 植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 動(dòng)

26、物細(xì)胞：TALE原理可行，各細(xì)胞系效率不一。 斑馬魚(yú)：有TALEN基因敲除報(bào)道，尚無(wú)點(diǎn)突變與敲入報(bào)道。 小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚無(wú)報(bào)道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)）。 TALEN應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵： 切實(shí)可靠的表達(dá)系統(tǒng)。 高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。,TALEN與主要類(lèi)同技術(shù)比較,siRNA 優(yōu)于TALEN 可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速觀察效果 Knockdown效果確實(shí)，可用于必須基因 遜于TALEN 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果短暫 不是徹底knockout 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機(jī)整合 ZFN 優(yōu)于TALEN 經(jīng)驗(yàn)積累多，技術(shù)較成熟 遜于TALEN 技術(shù)復(fù)雜，難度高，被Sigma公司壟斷 靶點(diǎn)序列要求高

27、，難找 Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重 經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性,CRISPR-Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù),Biotechnology: Rewriting a genome Nature495,5051(07 March 2013)doi:10.1038/495050a,1 CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。 2013以后

28、，研究者們?cè)诎╯cience和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類(lèi)、小鼠、斑馬魚(yú)等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。,CRISPR-Cas主要由兩部分組成：,識(shí)別,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR結(jié)構(gòu),CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家

29、族, 廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats) 組成, 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列(spacer)隔開(kāi)。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。,1.1 CRISPR結(jié)構(gòu),1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類(lèi)似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),CRISPR-Cas是很多細(xì)菌

30、和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免疫, 而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR 間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過(guò)增加或刪除間隔序列（spacer）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求,最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）為NGG。,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求,在人類(lèi)基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)NGG PAM。,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求,3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾,3