1、人IL-10定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒IL-10簡(jiǎn)介：人IL-10 是由160個(gè)氨基酸組成4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的的細(xì)胞因子，分子量為18.5 kDa。在水溶液中以二聚體形式存在，分子量約為39 kDa。人IL-10是個(gè)多效性的因子，能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞起作用，主要表現(xiàn)為免疫抑制和免疫刺激兩方面的作用，特別是在調(diào)節(jié)淋巴系和髓系的細(xì)胞功能方面扮演重要的作用。IL-10 也具有單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞依賴、抗原刺激引起的的PBMNC 和 NK 細(xì)胞合成其它細(xì)胞因子的抑制作用。巨噬細(xì)胞膜介導(dǎo)的共刺激引起的T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化后的產(chǎn)物及功能也可被IL-10所抑制。IL-10是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能的強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)物。IL-1

2、0作為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抑制物，能夠抑制像前列腺素E2、TNF-、IL-1、IL-10和 IL-8等許多引起炎癥的細(xì)胞因子。IL-10 能夠促進(jìn)可溶性TNF受體的釋放和ICAM1和B7在細(xì)胞表面的表達(dá)。IL-10還參與B細(xì)胞、柱狀細(xì)胞及胸腺細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)控。人的IL-10與鼠類的IL-10在DNA序列和氨基酸序列上高度同源，其DNA序列中一個(gè)開(kāi)放的基因框與艾伯斯坦-巴爾病毒基因組上基因框BCRF1高度同源，這可能在病毒感染中扮演重要角色的原因。在許多與寄生蟲感染的報(bào)道中，IL10表達(dá)也會(huì)增加，如曼森氏血吸蟲感染、利什曼原蟲感染、弓形蟲感染、錐蟲感染等。分枝桿菌的感染如麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核

3、桿菌、鳥分枝桿菌等的感染也會(huì)引起IL10的表達(dá)升高。檢測(cè)原理:本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中IL-10 的濃度。IL-10 捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的IL-10 會(huì)與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗人IL-10 抗體后，抗人IL-10 抗體與IL-10 接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)；其它游離的成分通過(guò)洗滌的過(guò)程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-10 將會(huì)形成免疫復(fù)合物

4、，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入中止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀其450nm處的OD值，IL-10 濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IL-10 濃度。人定量分析酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒組成:組分規(guī)格（96T/48T）人IL-10預(yù)包被板12條 / 6條樣本分析緩沖液5ml/3 ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液10ml/5ml人IL-10標(biāo)準(zhǔn)品4支/2支(凍干)人IL-10生物素化抗體10ml/5ml親和素連接的HRP酶10ml/5ml濃縮洗滌液 2030ml/15mlTMB底物10ml/5 ml中止液5ml/3 ml封板膠紙3/2張

5、說(shuō)明書1份標(biāo)本收集:1.標(biāo)本的收集請(qǐng)按下列流程進(jìn)行操作：A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液； C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集； D. 若待測(cè)樣本不能及時(shí)檢測(cè)，標(biāo)本收集后請(qǐng)分裝，凍存于20，避免反復(fù)凍融。2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測(cè)前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過(guò)離心去除；4.請(qǐng)勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測(cè)，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。注：正常人血清或血漿樣本請(qǐng)用標(biāo)本緩沖液做倍比稀釋后再檢測(cè)。注意事項(xiàng):1.試劑盒請(qǐng)保存在28。2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請(qǐng)水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。3.

6、標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部分請(qǐng)丟棄。4.底物請(qǐng)勿接觸氧化劑和金屬。5.加樣時(shí)，請(qǐng)及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。6.嚴(yán)禁混用不同批號(hào)的試劑盒組份。7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕叩擊邊緣以保證混勻。8.室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在2528。9.洗滌過(guò)程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙復(fù)孔。11.加樣過(guò)程中避免氣泡的產(chǎn)生。12.血清和血漿標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫平衡20分鐘；每次檢測(cè)后剩余試劑請(qǐng)及時(shí)于28保存。2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份

7、加19份水)。3.標(biāo)準(zhǔn)品:加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液0.25ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品瓶中使IL-10終濃度達(dá)到2000pg/ml，室溫反應(yīng)，請(qǐng)嚴(yán)格控制在2528。靜置15分鐘后輕輕混懸待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測(cè)孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為2000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）洗滌方法:自動(dòng)洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。實(shí)驗(yàn)過(guò)程需自備的材料：1. 不同規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭； 2.酶標(biāo)儀； 3自動(dòng)洗板機(jī)； 4去離子水或雙蒸水；操作步驟:1.通過(guò)計(jì)算并確定一次性實(shí)

8、驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請(qǐng)放回鋁箔袋密封，保存于4。2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對(duì)于血清或血漿標(biāo)本，請(qǐng)加入50ul樣本分析緩沖液后加50ul標(biāo)本，如稀釋量大，請(qǐng)將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。 4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。 6.洗板5次，

9、且最后一次置厚吸水紙上拍干。7.加入酶結(jié)合物工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20分鐘。8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫孵育20分鐘。10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值。結(jié)果判斷:1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測(cè)量值。2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度

10、時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。典型數(shù)值和參考曲線濃度pg/ml典型OD值1典型OD值2OD平均值00.110.13320.121662.50.24680.36620.30651250.31040.41340.36192500.47480.6110.54295000.90451.06470.984610001.47871.52411.501420002.03342.24612.13975人IL-10參考標(biāo)準(zhǔn)曲線注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。靈敏度，特異性和重復(fù)性:1.靈敏度：多次重復(fù)結(jié)果表明，最小檢出量為8.8pg/ml。2.特異性：與人IL-10 sR,IL-10 R,IL-22,IL-24小鼠IL-10和貓IL-10等沒(méi)有交叉反應(yīng)。3.重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均10