1、不同植物樣品可溶性蛋白含量和多肽組分的差異一實驗目的與意義1.掌握冷凍離心機的操作使用方法。2.掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。3.掌握分光光度計的使用方法和原理。4.掌握可溶性蛋白的定量測定方法和原理。5.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理和基本操作過程。二試劑與儀器試劑：Tris60g ，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5g ，-巰基乙醇2.5ml，蛋白酶抑止劑（PMSF 苯甲基磺酸氟）；100 g mL 牛血清白蛋白（125mg），考馬斯亮藍 G-250（500mg），90 乙醇（250mL），85 （ W V ）的磷酸（500mL）；Na2HPO412H2O（250g），NaH2PO42H2

2、O（50g），SDS（500mg），巰基乙醇（0.5ml），甘油（5ml），溴酚藍（10mg），0.2mol/L pH磷酸鹽緩沖液（3L），Acr（150g），Bis（10g）， TEMED（10ml），AP（50g），冰乙酸（350ml），甲醇（250ml），50%甲醇（2L），冰乙酸（200ml），儀器：研體，燒杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴，離心機；分光光度計，燒杯，量筒，移液管，試管（8個），100mL容量瓶（2個），1000mL容量瓶（4個），棕色瓶，夾心式垂直板電泳槽（附帶凝膠模1351001.5mm，1臺/組），直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V，電

3、流50100mA），微量注射器（10或50L），大培養(yǎng)皿（120160mm 1個），棕色瓶（4個），三實驗材料馬鈴薯 根 莖 葉四試驗方法與操作過程不同植物樣品可溶性蛋白的提取設備：研體，燒杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴；試劑：1.提取緩沖液：（0.0125mol的Tris-Hcl，pH7.0），稱取12.5gTris于燒杯，用適量雙蒸餾水溶解，HCL調PH至7.0，定容至1000Ml.2. 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5g3. -巰基乙醇2.5ml4.蛋白酶抑止劑（PMSF 苯甲基磺酸氟）操作步驟：1.將買來的新鮮馬鈴薯整株清洗干凈，分別剪取馬鈴薯的根 莖 葉。分

4、別準確稱取3g植物材料于研缽中，加入10ml預冷的提取緩沖液（Tris緩沖液，Ph7.0），1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.5ml的-巰基乙醇，可加入蛋白酶抑止劑（PMSF 苯甲基磺酸氟），置冰浴研磨勻漿，至20分鐘。2、將研磨勻漿轉移到塑料離心管并編號，提取液總體積10ml左右。先在4500r/min下離心20min，傾出上清液，并測定溶液體積，然后在10000rmin條件下離心10分鐘，用吸管吸取上清液，至容量瓶中，定容至l00ml，并貼上標簽。此即為植物不同樣品中可溶性蛋白的提取液?？扇苄缘鞍缀康臏y定儀器：分光光度計，燒杯，量筒，移液管，試管（8個），100mL容量瓶，1000mL容

5、量瓶，棕色瓶，試劑：1 標準蛋白質溶液（ 100 g mL 牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸餾水稀釋至 100 mL 即可。 2 考馬斯亮藍試劑：稱取 100 mg 考馬斯亮藍 G-250 ，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入 100 mL 85 （ W V ）的磷酸，再用蒸餾水定容到 1000 mL ，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個月。操作步驟1、標準曲線的繪制。取6支試管，按下表加入試劑，搖勻，向各管中加入5 mL 考馬斯亮藍試劑，搖勻，并放置 5 min 左右，以 0 號試管為空白對照，利用分光光度計在 5

6、95 nm 下比色測定吸光度。以蛋白質含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。2、樣品測定分別從三種蛋白提取液中測定其中所含蛋白的含量，因此，分別吸取先前提取的可溶性蛋白提取液1ml，加入 5 mL 考馬斯亮藍試劑，搖勻，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得每種提取液中的蛋白質含量。試管編號0123451mg/L標準蛋白溶液/ml蒸餾水考馬斯亮藍1.05.00.20.85.00.40.65.00.60.45.00.80.25.01.005.0標準蛋白濃度(ug/ml)020406080100A595nm聚丙烯凝膠電泳分離可溶性蛋白試劑1.連續(xù)體系SD

7、SPAGE有關試劑1）0.2mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液：稱 Na2HPO412H2O51.58g及NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。2) 樣品溶解液（上樣液）：10ml/組01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，內含1%SDS、1%巰基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚藍。用來溶解標準蛋白質及待測蛋白質樣品。配制方法見表3-2：SDS巰基乙醇甘油溴酚藍0.2mol/L pH磷酸鹽緩沖液加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml1ml2mg0.5ml10ml表3-2 連續(xù)體系樣品溶解液3) 凝膠貯液：稱Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，過濾后置棕色

8、瓶內，4貯存可用12個月。4) 凝膠緩沖液：6ml/組稱SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液至100ml。4貯存，用前稍加溫使SDS溶解。5) 1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶內4貯存。6) 10%過硫酸銨（AP）：1ml/組稱AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶內4貯存。7) 電極緩沖液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液）：稱SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水定容至1L。8) 2%瓊脂（糖）粉：20ml/組稱瓊脂（糖）2g，加100ml上述電極緩沖液，4貯存。固定液：取5

9、0%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。2. 脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1L儀器夾心式垂直板電泳槽（附帶凝膠模1351001.5mm，1臺/組），直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V，電流50100mA），微量注射器（10或50L），大培養(yǎng)皿（120160mm1/組），1000mL容量瓶（2個），棕色瓶（3個）操作步驟1、蛋白質樣品的處理。分別取0.5ml植物可溶性蛋白提取液于試管中，并加入樣品溶解液，1:1混合在一起，每種樣品都編上號。2、凝膠及電泳儀的準備安裝好電泳槽后，按附表表格配制濃度為7%的凝膠，配制好的凝膠迅速加入電泳槽的兩塊玻璃板的縫隙中，并插入梳子，等待凝

10、膠聚合20分鐘。將制好的凝膠板夾在電泳槽上，向上下槽注入電極緩沖液，取下樣品梳。3、加樣。將微量進樣器分別吸取之前制好的樣品溶解液，按次序插入樣槽下部慢慢進樣。每槽點樣10g。在另一個樣槽中按同樣方法加入標準蛋白質樣品。4、電泳（不連續(xù)電泳）上槽接負極，下槽接正級，接通電源，當樣品在濃縮膠時電壓為80V，進入分離后電壓調為120V，電泳至溴酚藍標志到達凝膠前沿為止。將電流、電壓調至零后斷電。5、凝膠板剝離電泳結束后，取下玻板，揭掉膠布，抽出夾條，將兩塊玻板置自來水龍頭下，借助水流，用解剖刀柄輕輕從板側縫間撬開玻板（注意切忌從凹槽處撬），將膠放入固定液。6、凝膠的固定、染色和脫色將凝膠放入染色液中染色40分鐘，然后用蒸餾水沖洗附著于膠面的染料，再將膠浸入脫色液中脫色，更換脫色液幾次，直到背景清晰為止 將脫過色的凝膠照像作為實驗報告的憑證。繪制電泳分離示意圖，比較分析找到有差異的蛋白條帶，