1、1,徐州醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室,常規(guī)組織病理技術(shù),2,病理學(xué)是研究疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律的 學(xué)科，主要的研究范圍是疾病發(fā)生發(fā)展過程中組織、細(xì)胞代謝、功能及結(jié)構(gòu)的變化。 病理學(xué)的發(fā)展與科學(xué)技術(shù)發(fā)展息息相關(guān)，因?yàn)椴±韺W(xué)的發(fā)展與使用的工具和方法（即技術(shù)）的更新密切相關(guān)。,3,解剖剪刀,尸體解剖,器官病理學(xué),顯微鏡,細(xì)胞,細(xì)胞病理學(xué),電 鏡,超微結(jié)構(gòu),超微病理學(xué),免疫學(xué),免疫組化,免疫病理學(xué),分子生物學(xué),分子病理學(xué),計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò),信息病理學(xué),工具和方法的更新與病理學(xué)的發(fā)展,4,病 理 學(xué) 理 論,病 理 學(xué) 技 術(shù),病 理 學(xué) 理 論,5,技術(shù)是病理學(xué)發(fā)展之母！,6,病理學(xué),傳統(tǒng)病理學(xué) 現(xiàn)代病理學(xué) 形態(tài)學(xué) 以

2、形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ) 器官病理學(xué) 與其他技術(shù)相結(jié)合 細(xì)胞病理學(xué) 免疫病理學(xué) 超微病理學(xué) 分子病理學(xué) ,7,8,免疫組化 HE,乳腺導(dǎo)管,9,免疫熒光 HE,10,結(jié)腸癌 EB病毒原位分子雜交,11,Fish檢測 人類表皮生長因子受體2基因 （human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）,12,常規(guī)組織病理技術(shù),內(nèi)容 formalin固定 石蠟切片制作 HE染色等 基本研究形態(tài)學(xué)必不可少的重要方法 基礎(chǔ)常規(guī)組織病理技術(shù)是現(xiàn)代新技術(shù)基礎(chǔ) 優(yōu)點(diǎn)簡單易操作，基本滿足日常工作需要 （常規(guī)技術(shù)、常規(guī)染色）,13,取材,HE染色,封固,常規(guī)技術(shù)基本流程,固定,切片,常規(guī)

3、技術(shù)的完成是制作出染色良好的HE切片,脫水、透明、 浸蠟、包埋,14,HE,15,第一節(jié) 組織與細(xì)胞標(biāo)本的選擇,組織標(biāo)本的選擇即取材，取材的目的是正確的獲取所需要的標(biāo)本或標(biāo)本的某一部位。,16,一、 組織標(biāo)本的選擇（取材）,從大體標(biāo)本上按病理檢查或研究的目的、要求切取適當(dāng)大小的組織塊，供制片進(jìn)行顯微鏡檢查。,17,材料要求：新鮮、數(shù)量、質(zhì)量 取材包括兩個步驟： 從人體（活檢、手術(shù)、尸檢）或動物體上獲取器官、組織 進(jìn)一步將其切取為制片所需組織塊,18,切取組織塊必須注意下列幾點(diǎn)： 1.避免人為損傷組織： 2.取材部位 總的要求能夠反應(yīng)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及病變特點(diǎn)且能夠表明病變部位與周圍組織的關(guān)系。 （

4、1）組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu),19,腎臟取材,20,取材,21,（2） 組織塊的采取應(yīng)在主要病變部位及正常與病變交界處,22,23,（3）腫瘤標(biāo)本的選擇 腫瘤本身、邊緣、腫瘤連同臟器表面和底、切端，轉(zhuǎn)移灶，盡量避開繼發(fā)病變,24,乳腺癌,25,胃,26,注意包埋面,27,3. 組織塊大小 一般不超過 21.50.3cm為宜,28,4.取材數(shù)量 原則: 凡可疑處均要取材,29,5. 編號、標(biāo)記,30,6.取材剩余組織塊可放于70%酒精中保存 有利于日后再取材時細(xì)胞染色，瓶子內(nèi)外亦需以標(biāo)簽注明號碼。 注意：盡量保留一定量的組織 不要隨意丟棄標(biāo)本,31,脫鈣 骨組織需先脫鈣再取材,32,二、細(xì)胞

5、取材及制片 收集和制片方法 1.印片法 2.穿刺法 3.沉淀法 4.活細(xì)胞標(biāo)本的制備,33,第二節(jié) 組織的固定,凡是需要制作病理檢查標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本還是大體標(biāo)本，首先必須固定。固定的目的是使離體的組織、細(xì)胞盡量保持生活狀態(tài)以利觀察、研究。,34,一、概念 將各種組織浸入某些化學(xué)試劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)能盡量保持其生活狀態(tài)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置，叫做固定。,35,二 .固定組織的目的 （1）保持細(xì)胞與生活時的形態(tài)相似（自溶、 腐敗）； （2）固定可使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等 各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，保持其原來結(jié)構(gòu)； （3）增加組織對染料的親和力 ，易著色； （4）組織硬化，便于

6、取材、切片。,36,由組織固定不當(dāng)或不良對標(biāo)本造成的影響是無法糾正和彌補(bǔ)的!,37,38,39,40,三. 固定注意事項(xiàng) （1）固定的組織越新鮮越好 （2）固定液的量：約1：10 固定容器：足夠大 , 開口不宜太小 （3）固定的溫度：室溫(25) （4）特殊類型染色對固定要求嚴(yán)格，組織的大小、 固定的時間、溫度的適當(dāng)都應(yīng)注意。,41,有專家說：若你能取到新鮮的組織，能切到厚24mm的切塊和記得固定液是十倍于組織塊的總體積，你的診斷的正確性已得到了80的保證。,42,四. 固定劑和固定液 用于固定組織的化學(xué)物質(zhì)稱為固定 劑或固定液。,固定劑/單純固定液由單一化學(xué)物質(zhì)組成,混合固定液/復(fù)合固定液由

7、多種化學(xué)物質(zhì)混合組成,43,(一)單純固定液 1. 甲醛： 優(yōu)點(diǎn) 固定后的組織很少收縮。 能保存脂肪和類脂質(zhì)（用冰凍切片法），也可固定高爾基體、線粒體， 又是糖的保存劑，使肝糖變成微細(xì)的顆粒團(tuán)。 穿透力強(qiáng)（4小時穿透深度2.7mm，8小時為4.7mm，12小時為5mm），固定均勻，能增加組織的韌性，便于取材。 甲醛固定的標(biāo)本核染色甚佳。 價格低廉。,44,缺點(diǎn)： 經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織易發(fā)生黑色或棕黑色的沉積（粒狀結(jié)晶），稱甲醛色素。 甲醛氧化 - 蟻酸與血紅蛋白結(jié)合福爾馬林色素 避免長時間固定， 固定后流水沖洗 尿酸結(jié)晶可被溶解。,45,甲醛固定液的配制: （1）10% f

8、ormalin 市售甲醛（濃度為3740%） 1份 水 9份 (2)中性甲醛 以PH7.2-7.4PBS為溶液配制的甲醛固定液,46,優(yōu)點(diǎn)： 如要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。 在已用別種固定液后，可用70%酒精較久的保存組織。 酒精既有固定作用，又有脫水作用。,2.乙醇,47,缺點(diǎn)： 經(jīng)酒精固定的標(biāo)本對核的染色不良，也不利于 染色體的固定。 要證明細(xì)胞含的脂肪和類脂質(zhì)時，不能用酒精固定。 如要證明組織內(nèi)的色素時，不宜以酒精作為固定劑。 不適用于固定大塊組織。 酒精價格較貴。,48,80%-95%的酒精作為固定劑為好 高濃度酒精組織硬化顯著,放置過久組織收縮明顯且質(zhì)脆,不但影

9、響制片, 組織形態(tài)也不好。 很少單獨(dú)使用,49,（二）復(fù)合固定液 1.A-F液（酒精-甲醛固定液） 有固定兼脫水作用 配制方法: 95%酒精（A） 90ml 40%甲醛（F） 10ml,50,2.Carnoy液 固定胞漿和胞核,對染色體固定佳,顯示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏體的固定.不能保存脂質(zhì) 有防止酒精的硬化收縮作用,穿透力強(qiáng),適用于外膜致密的組織 配置方法： 無水酒精60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml,51,五.常用的固定方法浸泡法 其他方法： 蒸汽固定法：甲醛蒸汽 小而薄的組織、細(xì)胞 細(xì)胞涂片的固定方法 可采用浸入法和滴加法 防摩擦脫落 防交叉污染 防混淆 微波固定法

10、：優(yōu)點(diǎn)是核膜清晰，染色質(zhì)均勻，組織收 縮??；缺點(diǎn)是時間及溫度(63-65 ) 不易控制 灌注固定法,加熱蒸汽,52,組織固定后的沖洗 流水沖洗 沖洗的時間與組織塊的大小、固定時間的長短有關(guān) 大標(biāo)本24小時 小標(biāo)本 210小時,53,第 三 節(jié),組織切片技術(shù),54,脫水,透明,浸蠟,封固,制作切片的方法和程序,制作切片的主要過程,包埋,染色,切片,55,一、 脫 水 某些溶劑置換組織內(nèi)水分的過程 （一）目的 石蠟切片 組織中含大量水分 水與石蠟不能混合 必須脫去組織中的 水分,脫水必須干凈徹底,!,56,（二）脫水劑 能夠使組織脫水的化學(xué)物質(zhì)稱為脫水劑。 常用脫水劑；與水任意比例混合 酒精、丙酮

11、、正丁醇、叔丁醇、環(huán)己酮,酒精,水,二甲苯,57,（三）脫水步驟和時間 脫水時間和組織塊大小有關(guān)，一般大小為1.81.8，厚約0.20.3的組織，其脫水步驟和時間如下： 70%酒精 12h 80%酒精 24h 90%酒精 24h 95%酒精 24h 95%酒精 24h 無水酒精 24h 無水酒精 24h,遞增酒精濃度可避免組織過度收縮,58,自動脫水機(jī),59,(四) 脫水的注意事項(xiàng) 組織脫水必須掌握由低濃度向高濃度逐步過渡的原則 脫水時間要適度 組織脫水要徹底干凈 酒精的濃度 適時更換 降級使用,！,60,二、 透明 組織經(jīng)酒精脫水后，還必須經(jīng)過一個媒劑透明過程,既與酒精混合 又溶解于石蠟,酒

12、精,石蠟,媒劑,使組織透明,61,常用透明劑 二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油等 最常用 二甲苯（折光率1.497） 約30min,62,三 、 浸蠟 經(jīng)過透明的組織塊，進(jìn)一步移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬，稱為浸蠟。用其他浸透劑（火棉膠，碳蠟，明膠等）滲入組織內(nèi)部的過程稱為浸透或透入 目的：使石蠟充分進(jìn)入組織中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊而便于切片,63,注意: 在浸蠟過程中，一般要2次或3次更 換蠟缸 浸蠟時間，一般更換3次石蠟總共在 3h左右 浸蠟在溫箱中進(jìn)行 溫度！ 浸蠟用的石蠟要定期更新（降級使用） 浸蠟用石蠟熔點(diǎn)較低,52-56,64,四、包 埋 使用包埋劑將處理過的組織包于其中，使組

13、織達(dá)到一定韌度和硬度，有利于切片。 石蠟包埋法；快速石蠟包埋法等,65,66,包 埋,67,68,69,蠟塊,70,71,組織芯片制作方法： 組織芯片又稱組織微列陣，是將數(shù)十個、數(shù)百個、乃至上千個小的組織片整齊的排列在某一載體上（通常是載波片）而成的微縮組織切片。 制作：采用石蠟包埋法 優(yōu)點(diǎn)：方法簡單易操作 各組織基本在同一平面 蠟與組織融合較好，不會出現(xiàn)崩塊現(xiàn)象 較小的蠟塊可以包埋較多的組織,附,72,五 石蠟切片 組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程稱為石蠟切片法。 一般切成46 m ，特殊情況可切12 m 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便 、便于大批制作、便于長期保存,73,切片前的準(zhǔn)備：

14、高質(zhì)量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵 清潔的載玻片、恒溫烤片裝置、優(yōu)質(zhì)狼豪毛筆、彎嘴鑷 過程：切片、貼附、烤片,74,輪轉(zhuǎn)式切片機(jī),切片,75,76,組織漂烘儀,40, 蠟的熔點(diǎn),6070 ,貼片,77,切片的注意事項(xiàng) 首先要求切片刀鋒利，刀口無缺損，才能切出完整薄片 蠟塊四周在切片時應(yīng)修切整齊，尤其是上、下緣，要求平行 切片刀及蠟塊都要固定牢靠，機(jī)身的各個部分及螺絲應(yīng)予旋緊， 不可產(chǎn)生震動，搖動切片機(jī)時，用力不能過猛，以保持機(jī)身平 穩(wěn)，防止震動 切片刀傾角不宜過大或過小，以2030為佳 石蠟過軟或室溫過高，切片易粘于切片刀上，或發(fā)生皺縮，此時 可將蠟塊置于水槽內(nèi)冷凍后再切。反之，如

15、室溫過低或石蠟過 硬， 切不成片時，可在蠟塊切面上哈氣加溫,78,附：冰凍切片,保存酶類和抗原活性，尤其是對熱或有機(jī)溶劑耐受能力弱的酶及細(xì)胞表面抗原,術(shù)中快速病理診斷、某些特殊染色、某些免疫組織化學(xué)染色,原位分子雜交,注意：用于切片形態(tài)學(xué)觀察要注意防止冰晶形成-速凍,科學(xué)研究：RNA，DNA提取,79,普通染色HE 蘇木精hematoxlin和伊紅eosin染色 常規(guī)染色 染色的目的：增加組織在顯微鏡下的分辨率 HE染色 主要用以顯示各種組織、細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)以及疾病過程中病變的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)的過程。,常規(guī)染色,特殊染色,80,（一）染色原理 1、細(xì)胞核染色原理：核酸陰離子+蘇木素陽離子藍(lán)

16、色 2、細(xì)胞漿染色原理：蛋白質(zhì)陽離子+伊紅陰離子伊紅色 PH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 3、分化和藍(lán)化作用： 分化：1%鹽酸脫去多余染液 藍(lán)化：弱堿性液體使蘇木素處于藍(lán)色離子狀態(tài)而 使細(xì)胞核染上藍(lán)色,81,染色缸,染色架,82,全自動染色機(jī),83,（二）染液及溶液的配制 1、蘇木精染液 染核 蘇木精染液的配制方法很多，如哈瑞（Harris）蘇木精染液，埃利希（Ehrlich）蘇木精染液，德拉菲爾德（Delafield）蘇木精染液，邁耶（Mayer）蘇木精染液，克拉茲（Carazzi）蘇木精染液等。,84,2、伊紅染液染胞漿 伊紅染液的濃度為.。一般而言，其濃度低時，染色時間延長。 可以是水溶液，也可以

17、是醇溶液。,85,3、分化液 a) 1%鹽酸酒精溶液：鹽酸1ml，70%酒 精99ml b) 0.5%1%鹽酸水溶液：鹽酸0.5 1ml，加蒸餾水99ml 以上兩種溶液以1%鹽酸酒精溶液最常用。,86,4、 弱堿性水溶液 (1)碳酸鋰水溶液：碳酸鋰1.25g溶于蒸餾水 100ml。PH值為8.0左右。 (2)氫氧化銨水溶液：將氫氧化銨（氨水）逐滴 加入蒸餾水中，經(jīng)攪拌后，用pH試紙檢驗(yàn) 溶液，pH值調(diào)至7.58.0之間即可。 【注意】以上兩種“弱堿性水溶液：為返藍(lán)劑，使蘇木精染色返為藍(lán)色。使用流水沖洗12h也可起到返藍(lán)作用，因?yàn)樽詠硭喑嗜鯄A性。,87,（三）染色程序與方法 常規(guī)石蠟切片HE染

18、色大體分三個步驟： 1、染色前切片脫蠟水洗 染色劑為水溶性，水與石蠟不溶，在染色前必須將石蠟脫盡，否則不能染色。 脫蠟時間寧長勿短。,二甲苯 脫蠟,酒精 洗去 二甲苯,水,88,步驟： （1）二甲苯5min（烘干切片浸入，脫蠟） （2）二甲苯15min（充分溶解殘存切片上石蠟） （3）無水酒精12min（洗去二甲苯） （4）無水酒精12min（徹底洗出二甲苯） （5）95%酒精12min （6） 85%酒精12min （7）70%酒精12min（用各級酒精清洗切片中的二甲苯， 同時切片逐步加水，不可直接由無水酒精入水，可致切 片漂浮脫落）。 （8）自來水洗12min （9）蒸餾水洗12min（

19、使水充分進(jìn)入切片有利于蘇木素染液 進(jìn)入胞核）,89,2 、HE染色 HE染色是先用蘇木精染液將切片組織過染，經(jīng)水洗后再用鹽酸酒精分化，弱堿性水溶液返藍(lán)。使胞核呈鮮明的藍(lán)色，胞質(zhì)及背景無色，再水洗后用伊紅染胞質(zhì)。,過 染 蘇木素,水 洗 分 化,藍(lán) 化,染 色 伊 紅,90,步驟 （1） 蘇木精染液15min （2） 自來水洗35min （3） 1%鹽酸酒精815min （分化） （4） 自來水洗15min （5） 弱堿性水溶液3060s （藍(lán)化） （6） 自來水洗510min(此時可在光鏡下觀察著色程度，如 不適可作相應(yīng)處理) （7） 蒸餾水洗12次 （8） 伊紅水溶液510min （9） 蒸

20、餾水洗12次（用水洗去未結(jié)合的染液）,91,3 脫水、透明、封固 常規(guī)石蠟切片HE染色的組織切片，均以干性封固劑（中性樹膠）封藏，便于觀察和長期保存。,二甲苯 透明,酒精 脫水,水,封固,92,封固劑 使染色后的組織封固于載玻片與蓋玻片 之間而不與空氣直接接觸，避免氧化褪色；折光率與玻片的折光率相似。 透明 用二甲苯使組織透明（折光率）以利光線通過。,93,步驟 (1) 70%酒精12min (2) 0.5%伊紅酒精溶液0.52min (3) 80%酒精12min (4) 95%酒精12min (5) 無水酒精15min (6) 無水酒精15min (7) 二甲苯石炭酸混合液12min (8)

21、 二甲苯12min (9) 二甲苯12min (10) 中性樹膠封固,94,染色注意事項(xiàng) 1. 脫蠟水洗中的問題 1） 脫蠟時間寧可長些，不應(yīng)過短，否則脫蠟不盡，無法著色。 2） 用各級酒精清洗切片中的二甲苯，同時使切片逐步加水。,95,2.染色時間問題 （1）蘇木精染色時間 染色時間之長短不可能一成不變，與不同的組織，取材的新舊，組織固定液的不同，環(huán)境溫度等有密切關(guān)系，因此染色時間必須根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握。 （2）伊紅染色時間 伊紅染色程度應(yīng)以蘇木精對核著色程度為參照標(biāo)準(zhǔn)，以求達(dá)到對比鮮明。,96,3.分化問題 分化處理恰當(dāng)，即核的顏色達(dá)到適宜程度，應(yīng)立即終止分化，經(jīng)水洗，返藍(lán)后，經(jīng)顯微鏡觀察，核膜及核染色質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)顯示清楚。 為了控制好分化程度，操作中應(yīng)注意如下問題： （1）鹽酸酒精分化液濃度一般不易超過1% 。 （2）分化不足和分化過度都不能獲得良好的切片 （3）操作中除肉眼觀察大致確定切片著色和分化程度，還必須經(jīng)光學(xué)顯微鏡下觀察確定。