1、云南大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告課程名稱： 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)院系：生命科學(xué)學(xué)院年級專業(yè)：2013級生物技術(shù)（國家生命科學(xué)與技術(shù)基地班）姓名：楊夢梅選課號：學(xué)號：座號：A2開課日期：2015.09 學(xué)期：2015秋季學(xué)期任課教師：呂琦、牛蕓云南大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 制胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究第一作者：楊夢梅 同組實(shí)驗(yàn)者：趙姍( 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 昆明 )摘 要: 以胡蘿卜肉質(zhì)根為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織, 并建立細(xì)胞懸浮系. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 胡蘿卜肉質(zhì)根是誘導(dǎo)愈傷組織和進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的可行外植體; 誘導(dǎo)致密型愈傷組織的最佳激素濃度配比是 0.5 mg/ L 2,

2、 4- D+ 0.4 mg/ L KT;繼代培養(yǎng) 1代 2時(shí),可得到高活性的懸浮細(xì)胞系；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過 14 天達(dá)到高峰期（生長平臺）。關(guān)鍵詞: 胡蘿卜; 組織培養(yǎng); 細(xì)胞懸浮培養(yǎng); 致密型愈傷組織; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots callusAbstract: Carrots flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The ex

3、perimental results show that: Carrotsflesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with h

4、igh activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡蘿卜( Daucus carota L . ) , 屬于十字花科植物, 是一種十分重要的蔬菜作物, 由于胡蘿卜肉質(zhì)根營養(yǎng)豐富，約含有88的水、68糖、12植物纖維，0712蛋白質(zhì)、1灰份及03脂肪 ，及其適于生食、加工、烹調(diào)等多種用途, 在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。中國是農(nóng)業(yè)大國, 胡

5、蘿卜作為蔬菜作物在人們生活中起著重要的作用。因此, 加快我國胡蘿卜育種研究以成為迫切需要。近些年來, 隨著生物技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 作為生物技術(shù)研究的理想材料, 許多國家對胡蘿卜體細(xì)胞雜交技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化與再生技術(shù)、分子標(biāo)記與基因克隆技術(shù)進(jìn)行了廣泛深入的研究。我國科研工作者在胡蘿卜的生物技術(shù)與分子 生物學(xué)研究上也取得了一定進(jìn)展, 特別是在組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合 、遺傳轉(zhuǎn)化及再生等方面。但是在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)方面并不是太多, 因此繼續(xù)深入研究還是很有必要的。本文對胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件進(jìn)行探討, 為其次生代謝產(chǎn)物- 胡蘿卜素、- 胡蘿卜素（維生素A前體）的生產(chǎn)

6、以及將來的工廠化和分子生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。1 材料和方法1. 1材料來源胡蘿卜肉質(zhì)根自農(nóng)貿(mào)市場購買. 1. 2 方法1. 2. 1MS培養(yǎng)基的配制1000ml1) 用大燒杯取蒸餾水100-120ml2) 依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量鈣鹽（10x）、10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml鐵鹽（100x）、10ml有機(jī)（100x）、100ml有機(jī)肌醇（10x）、以及適當(dāng)含量植物激素。 3) 稱取30g蔗糖加入，攪拌直至全部溶解，作為1號溶液備用。4) 稱取9g瓊脂，用量筒量取500ml蒸餾水一起加入1000ml體積白瓷缸中，放在電爐

7、上一邊加熱一邊攪拌，加熱直至清澈無沉淀。將1號溶液加入，繼續(xù)加熱攪拌，至將要沸騰，離火。5) 用pH試紙調(diào)pH至5.8-6.0 。6) 在白瓷缸中定容至1000ml，攪拌均勻。7) 分裝至350ml培養(yǎng)瓶中每瓶約4050ml。121高壓滅菌20min。探究實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)基代號基本培養(yǎng)基2，4-D mg/LKTmg/LM1MS無無M2MS1無M3MS20.5M4MS無11. 2. 2胡蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)( 1) 以胡蘿卜肉質(zhì)根形成層為外植體誘導(dǎo)。用自來水洗凈胡蘿卜肉質(zhì)根, 用小刀切成長約67cm塊段, 將其在 75% 的酒精中消毒 60s, 再用0. 1% 的升汞消毒 10min或用20%次氯酸鈉水

8、溶液消毒20min, 最后用無菌水漂洗三遍每遍510min.（2）消毒好的胡蘿卜根塊, 切去形態(tài)學(xué)下端的510mm厚的一片, 留下部分用消毒好的小刀, 沿截面橫切成厚度 35mm 左右的小圓片, 然后將小圓片的韌皮部和木質(zhì)部切去, 留下形成層, 再切成長 3mm, 寬 1. 5mm, 高 35mm 的小長塊, 分別接種在M1、M2、M3、M4的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上.（3）獲得愈傷后進(jìn)行繼代培養(yǎng), 培養(yǎng)環(huán)境條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)相同.1. 2. 3胡蘿卜愈傷組織的繼代（1）從培養(yǎng)瓶中取出愈傷組織，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用解剖刀將愈傷組織壞死部分剔除并將愈傷組織切成黃豆大小顆粒，放在無激素的新鮮培養(yǎng)基表面，用鑷子輕輕

9、壓實(shí)，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種23個(gè)切塊。用記號筆標(biāo)注操作者、組別和日期。（2）34周后在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次。1. 2. 4胡蘿卜細(xì)胞無菌系的建立懸浮培養(yǎng)（1）用鑷子夾取在固體繼代培養(yǎng)基上繼代 10d 左右的胚性愈傷組織即分散性好、疏松的愈傷, 稱取鮮重2g左右的胡蘿卜愈傷組織，在滅過菌的培養(yǎng)皿中用無菌鑷子盡量將其撥散。（2）將散碎的愈傷組織轉(zhuǎn)移入盛有20ml液體無激素MS培養(yǎng)基的三角瓶中。（3）置于80120r/min搖床上25暗培養(yǎng)。（4）每隔3天換液1次，用吸管吸去3/4舊培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)2 代 4 代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。1.2.5胡蘿卜細(xì)胞再分化實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胡蘿卜愈傷

10、組織的“器官分化”與“體細(xì)胞胚發(fā)生”（1）在超凈工作臺上，用鑷子去除繼代培養(yǎng)12次的疏松愈傷組織，在無菌載臺上分割成長 3mm, 寬 1. 5mm, 高 35mm 的小長塊，去除黑色、灰色或棕色的壞死細(xì)胞部分。（2）接種在M5、M6培養(yǎng)基上，每瓶13塊，輕輕壓實(shí)，以保證和培養(yǎng)基充分接觸。（3)標(biāo)注清楚組別和日期。26，光照16h/d，4周后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 1實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：2.1.1培養(yǎng)基配置結(jié)果：我們組負(fù)責(zé)配置的是M1，M2，M3，M4每種各接種兩瓶。2.1.2愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果：總接種瓶數(shù)8瓶總接種塊數(shù)23塊污染瓶數(shù)3瓶污染塊數(shù)5未污染瓶數(shù)5瓶未污染塊數(shù)18塊未污染塊中愈傷組織

11、發(fā)生塊數(shù)15愈傷組織發(fā)生率83.33%愈傷組織發(fā)生情況記錄18塊接種成功，其中有11塊愈傷組織的色澤較新鮮呈近乎白色，7塊顏色偏深黃，渾濁。污染情況及原因分析未成功的3瓶中，污染瓶中，有1瓶是霉菌污染，分析原因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)水分過多，因此要選擇水分適宜的培養(yǎng)基； 1瓶細(xì)菌污染，可能是接種過程中接種器械消毒不夠，掀開封口膜時(shí)碰到了封口膜里面，也可能是封口膜沒綁好；一瓶為在接種過程中胡蘿卜組織被燙傷，分析原因?yàn)槭中g(shù)刀在灼燒后沒有完全冷卻就使用，導(dǎo)致胡蘿卜切面被燙傷。2.1.3愈傷組織繼代培養(yǎng)結(jié)果：總接種瓶數(shù)4瓶總接種塊數(shù)11污染瓶數(shù)2污染塊數(shù)5未污染瓶數(shù)2未污染塊數(shù)6未污染塊中愈傷組織發(fā)生塊數(shù)6愈傷組

12、織發(fā)生率100%愈傷組織發(fā)生情況記錄6塊接種成功，其中有4塊愈傷組織的色澤較新鮮呈淺黃色，2塊顏色偏深黃，渾濁。污染情況及原因分析兩瓶都是在接種過程中胡蘿卜組織被燙傷，分析原因?yàn)槭中g(shù)刀在灼燒后沒有完全冷卻就使用，導(dǎo)致胡蘿卜切面被燙傷。2.1.4胡蘿卜細(xì)胞無菌系的建立懸浮培養(yǎng)結(jié)果：（以大組812人統(tǒng)計(jì)結(jié)果）瓶號接種質(zhì)量g3天后質(zhì)量g6天后質(zhì)量g14天后質(zhì)量g平均每天增值質(zhì)量g11.982.002.733.900.142.1.5胡蘿卜細(xì)胞再分化實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胡蘿卜愈傷組織的“器官分化”與“體細(xì)胞胚發(fā)生”結(jié)果：因?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)時(shí)間問題，還未觀察到具體結(jié)果。預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：如果愈傷組織脫分化以后進(jìn)行再分化，則應(yīng)當(dāng)

13、先時(shí)愈傷組織下部分化出根，在上部發(fā)育出芽，隨著不斷地生長，最終發(fā)育成完整的植株；如果是體細(xì)胞胚發(fā)生，則可以不經(jīng)過愈傷組織階段就可以發(fā)育為體細(xì)胞胚；但是體細(xì)胞胚比愈傷組織難生成得多，很多植物還無法進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)生成，體細(xì)胞胚一旦形成，便可慢慢的分化為完整的植株。與愈傷組織發(fā)生相比，體細(xì)胞胚更不容易發(fā)生遺傳變異，從而誘導(dǎo)分化發(fā)育成的植株更穩(wěn)定。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片第一次培養(yǎng)M1-1 M2-1 M2-2 M4-1 M3-1 培養(yǎng)成功 M4-2 霉菌M1-2 細(xì)菌污染M3-2 細(xì)菌污染 燙傷污染情況：接種8瓶，污染3瓶，5瓶未污染第二次培養(yǎng)1-2燙傷2-1霉菌1-1 愈傷組織2-2愈傷組織繼代實(shí)驗(yàn)情

14、況因未觀察到，所以未附圖。3.分析討論：3.1對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論3.1.1胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，被污染了5瓶，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，一定要注意無菌操作，否則，任何一個(gè)環(huán)節(jié)染菌都會導(dǎo)致外植體被污染，使得實(shí)驗(yàn)失敗。3.1.2外植體的選擇很重要，由于實(shí)驗(yàn)中選了根部上端，但切面比較靠內(nèi)的胡蘿卜，與其他組相比愈傷組織的量或是色澤方面都比較好，但切塊太小，也許是因?yàn)椴灰粯哟笮〉暮}卜，但消毒時(shí)間是一樣的，可能使得胡蘿卜組織受傷較重。3.1.3同一小組中，或同一個(gè)人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會不一樣，這是由于個(gè)人操作差異，主要是培養(yǎng)基分裝時(shí)沒混勻，以及無菌操作不夠規(guī)范，實(shí)驗(yàn)熟悉度不過造成的。3.1.4

15、外植體經(jīng)過消毒等處理，可在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織，并且通過改變2,4-D和KT的濃度，可以誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成植物體然后再在繼代培養(yǎng)基上可以增殖得到更多更好的愈傷組織。3.2實(shí)驗(yàn)總結(jié)3.2.1植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)一般歷時(shí)較長，因此要及時(shí)將實(shí)驗(yàn)過程中的每一部分的操作內(nèi)容以和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄下來。以后每門實(shí)驗(yàn)課都應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)備一本實(shí)驗(yàn)記錄本，用于記錄數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)問題時(shí)也方便排查問題所在。3.2.2由于是以小組形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以每個(gè)人的工作安排合理的話，可以提高效率。各個(gè)大組分別輪流成批配置培養(yǎng)基可地有效節(jié)約了時(shí)間與精力。3.2.3在本次實(shí)驗(yàn)中我了解并掌握了胡蘿卜愈傷組織的

16、誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的原理和一般流程。3.2.4對植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中熟練掌握無菌操作的技術(shù)十分的重要，它對實(shí)驗(yàn)的成功直接影響，可有效提高愈傷組織的成活率。3.2.5由于本次實(shí)驗(yàn)中所需的培養(yǎng)基配方是由老師提供的，所以對于培養(yǎng)基配方的確定這一方面的把握不夠。實(shí)驗(yàn)中愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)條件和時(shí)間等都是由老師進(jìn)行安排，我們只是來看結(jié)果，所以實(shí)際上，對于培養(yǎng)條件等我們都掌握不夠。3.2.7總得來說，對于實(shí)驗(yàn)操作流程和注意事項(xiàng)，以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察分析還是能夠掌握的。4. 展望拓展：這次的實(shí)驗(yàn)總體來說還是失敗的，第一次實(shí)驗(yàn)成功率低原因在于在做實(shí)驗(yàn)前沒有好好了解實(shí)驗(yàn)流程，雖然老師在上課時(shí)做了相應(yīng)的講解，但一

17、些細(xì)節(jié)上的操作和技巧還是沒有弄明白,對于無菌操作的重要性還是沒有深刻的意識。在第二次實(shí)驗(yàn)中我更加注意了這個(gè)問題，將無菌操作臺上的物品按最合理的方式放置，既不影響操作，也方便拿取，操作過程不離實(shí)驗(yàn)臺，儀器輕拿輕放，盡量不帶起空氣大幅度流動(dòng)，將酒精燈移到空氣濾膜附近，在整個(gè)過程都在酒精燈旁操作；另一方面，在以后的實(shí)驗(yàn)中自己一定要提前對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有所了解，將課件及實(shí)驗(yàn)講義上的知識吃透,理清實(shí)驗(yàn)思路。這是能做出成功實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),否則,在老師講解時(shí)聽不懂,自己思路不清晰，這將使我們在做實(shí)驗(yàn)時(shí)的難度加大,浪費(fèi)做實(shí)驗(yàn)的寶貴時(shí)間，實(shí)驗(yàn)也不易做成功。經(jīng)過這次的測試技術(shù)實(shí)驗(yàn),我個(gè)人得到了不少的收獲,一方面加深了我對課

18、本理論的認(rèn)識,另一方面也提高了實(shí)驗(yàn)操作能力。這次的實(shí)驗(yàn)跟我們以前做的實(shí)驗(yàn)不同，因?yàn)檫@次實(shí)驗(yàn)大部分是個(gè)人操作，我覺得這次我是真真正正的自己親自去完成，所以是我覺得這次實(shí)驗(yàn)最寶貴，最深刻的。比較高興的一點(diǎn)是我的愈傷組織成活率在同班同學(xué)里還是比較高的，在準(zhǔn)備愈傷組織的擴(kuò)大化培養(yǎng)中，大多數(shù)同學(xué)用的都是我的材料，心里感到很自豪。在這次的實(shí)驗(yàn)中我也深深體會到課本上的純理論知識對于實(shí)踐的指導(dǎo)作用：弄懂實(shí)驗(yàn)原理，然后通過實(shí)驗(yàn)的操作的靠自己親自動(dòng)手，親自開動(dòng)腦筋，親自去請教別人才能得到提高的。臨近期末，非常感謝牛蕓老師和呂琦老師在本學(xué)期給予我們的細(xì)致生動(dòng)的教學(xué)，也許以后不見得會再學(xué)習(xí)更多更加專業(yè)的后續(xù)課程，但是它對于我們拓展專業(yè)及相關(guān)知識面、溫習(xí)所學(xué)的細(xì)胞工程內(nèi)容、應(yīng)用理論分析問題、解決問題的方面體現(xiàn)的思維方式卻讓我受益匪淺。特別是牛蕓老師在指導(dǎo)我實(shí)驗(yàn)操作時(shí)說的那一句“這樣來控制會比較省力，可愛的孩子!”謝謝老師的悉心教導(dǎo)，在此，學(xué)