1、分光光度分析法：基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。包括比色法、可見(jiàn)分光光度法、紫外分光光度法、紅外光譜法等。1、基本原理：朗伯-比爾吸收定律當(dāng)一束平行單色光照射到有色溶液上時(shí)，光的一部分將被溶液吸收，一部分透過(guò)溶液，還有一部分被器皿的表面反射。在實(shí)際測(cè)量時(shí)，通常將試液和空白溶液分別置于同樣質(zhì)料及厚度的吸收池中，因而反射光強(qiáng)度基本不變（其余條件一致），其影響可以不予考慮。設(shè)入射光的強(qiáng)度為Io，透過(guò)光強(qiáng)度為It，溶液濃度為c，液層厚度為b，則：A=kbcA：吸光度，k為比例常數(shù)其中k的值隨b、c的單位而變。當(dāng)c為g/l時(shí)，k用a表示，稱為吸收系數(shù)當(dāng)c為mol/l時(shí)，k用表示，稱為摩爾吸

2、光系數(shù)反映吸光物質(zhì)對(duì)光吸收能力，也反映用分光光度法測(cè)定該吸光物質(zhì)的靈敏度， 越大，方法的靈敏度愈高。在多組分系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒(méi)有相互作用，這時(shí)體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。A總=A1+A2+A3+An吸光度與透光度的關(guān)系： It/ Io=T2、分光光度計(jì)基本部件：光源、單光器、吸收池（比色皿）、檢測(cè)器、顯示器3、吸光度測(cè)量條件的選擇A、波長(zhǎng)選擇：以最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)量的入射波長(zhǎng)稱為最大吸收原則。B、吸光度范圍的選擇：A為0.2-0.8，T為65-15%；當(dāng)A=0.434（T=36.8%）時(shí)測(cè)量的相對(duì)誤差最小。C、參比溶液的選擇：進(jìn)行測(cè)量時(shí)，利用參比溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀

3、器的零點(diǎn)，可以消除由于吸收池壁、溶劑、試劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的誤差，并扣除干擾的影響。參比溶液可根據(jù)下列情況來(lái)選擇。（1） 純?nèi)軇┛瞻祝寒?dāng)試液、試劑及顯色劑均無(wú)色時(shí)，可直接用純?nèi)軇ɑ蛘麴s水） 作參比溶液。（2） 試液空白：顯色劑為無(wú)色，而被測(cè)試液中存在其他有色離子，可用不加顯色劑的被測(cè)試液作參比溶液。（3） 試劑空白：試液無(wú)色，而試劑或顯色劑有顏色時(shí)，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。（4） 顯色劑和試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)， 使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其它試劑均按試液測(cè)定方法加入，以此作為 參比溶液，這樣就可消除顯色劑和一些共存組分的干

4、擾。（5） 改變加入試劑的順序，使被測(cè)組分不發(fā)生顯色反應(yīng)，可以此溶液作為參比溶液消除干擾。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作5、示差法測(cè)量高含量組分實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸鹽的測(cè)定目的要求1. 掌握亞硝酸鹽氮的測(cè)定原理和方法。2. 熟悉分光光度計(jì)的使用方法。3. 理順氨氮的氧化與硝酸氮的還原的過(guò)程，為測(cè)定氨氮和硝酸鹽氮奠定基礎(chǔ)。4. 了解亞硝酸鹽氮的快速測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸鹽的測(cè)定概述亞硝酸鹽氮是無(wú)機(jī)氮化合物之一，是氨氮被氧化和硝酸氮被還原的中間產(chǎn)物，不穩(wěn)定。通常以其亞硝酸根中的氮原子來(lái)計(jì)量，用符號(hào)N02-N表示。潔凈地面水中亞硝酸鹽氮的含量一般不超過(guò)0.01mg/L；海水中亞硝酸鹽氮含量的變化幅度為0.1

5、30g/L。養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽氮對(duì)水生動(dòng)物具有較強(qiáng)的毒性，作用機(jī)理主要是通過(guò)魚類等的呼吸作用，亞硝酸鹽由鰓絲進(jìn)入血液，使正常的血紅蛋白發(fā)生氧化，輸氧功能受到影響，出現(xiàn)組織缺氧從而導(dǎo)致魚蝦缺氧，甚至窒息死亡。亞硝酸鹽還可與仲胺類反應(yīng)生成致癌性的亞硝胺類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸鹽的測(cè)定方法選擇水中亞硝酸鹽氮的測(cè)定方法通常采用重氮偶聯(lián)反應(yīng)，使生成紅紫色染料。所用重氮和偶聯(lián)試劑種類較多，最常用的一般有對(duì)氨基苯磺酸和奈胺，該法簡(jiǎn)便，靈敏度高，但鹽度對(duì)吸光度有影響，而且試劑奈胺對(duì)人體有致癌作用，現(xiàn)今基本不再使用?；前罚▽?duì)氨基苯磺酰胺）和N-（1-萘基）-乙二胺鹽酸鹽（簡(jiǎn)稱萘乙二胺）法靈敏度更高，反應(yīng)速度

6、快， 試劑較為穩(wěn)定，而且不受鹽度等組分的影響，因此， 該法是目前國(guó)內(nèi)普遍采用的測(cè)定亞硝酸鹽氮的方法。當(dāng)將試劑配制成固體粉末時(shí)，適合于野外快速測(cè)定。此外，還有目前國(guó)內(nèi)外普遍使用的離子色譜法和新開(kāi)發(fā)的氣相分子吸收法。這兩種方法雖然須使用專用儀器，但方法簡(jiǎn)便、快速，干擾較少。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定磺胺和萘乙二胺試劑法原理在酸性介質(zhì)中亞硝酸鹽與磺胺進(jìn)行重氮化反應(yīng)，其產(chǎn)物再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色偶氮染料，在543nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。本方法最低檢出濃度(以N計(jì))為0.02mol/L，測(cè)定上限為10mol/L。主要儀器分光光度計(jì)及配套比色皿、25mL具塞比色管等。試劑1. 磺胺溶液（10g/L）：

7、稱取5g磺胺，溶于360mL鹽酸溶液（1+6）中，用純 水稀釋至500mL，貯于棕色試劑瓶中，有效期為2個(gè)月。2. 萘乙二胺溶液（1g/L）：稱取0.5g鹽酸萘乙二胺，溶于適量水后定容至500mL，貯于棕色試劑瓶中置冰箱內(nèi)保存，有效期為1個(gè)月。3. 亞硝酸鹽氮貯備溶液（100.0g/ml）：稱取0.2463g亞硝酸鈉（NaNO2，于110烘干），溶于少量純水中后全部轉(zhuǎn)移入500mL容量瓶中，加純水至標(biāo)線，混勻。4. 亞硝酸鹽氮使用溶液（1.000g/ml） ：取1.00mL貯備液于100mL容量瓶中，用純水稀釋至標(biāo)線，混勻。臨用前配制。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定操作步驟水樣預(yù)處理若水樣渾濁，可

8、通過(guò)以下方法預(yù)先處理?？扇∫欢w積的水樣，恒溫離心（4000或5000r/min，20min），取上清液備用。經(jīng)0.45m濾膜抽濾（采用針頭過(guò)濾器安裝0.45m濾膜擠壓過(guò)濾的方法，操作比較方便） 后得到澄清水樣備用。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定操作步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（1） 取8支25mL具塞比色管，分別加入下表所示體積的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)使 用溶液，加純水至標(biāo)線，混勻。水樣直接取樣至標(biāo)線（25ml）。（2） 每支比色管中分別加入0.5mL磺胺溶液，混勻，放置1min。（3） 分別加入0.5mL萘乙二胺溶液，混勻，放置顯色15min。（4） 在波長(zhǎng)543nm波長(zhǎng)處，用1cm比色皿，以純水作參比，測(cè)定吸光

9、度Ai。（5） 以上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的吸光度Ai扣除試劑空白（1號(hào)管）的吸光度，得到校正吸光度Ai （同時(shí)要考慮校正Ac），以校正吸光度Ai為縱坐標(biāo)，繪制吸光度對(duì)亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)12345678ml00.100.300.501.001.50水樣1水樣2mg/L00.00400.01200.02000.04000.0600實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定操作步驟水樣測(cè)定（1） 取適量水樣（V水樣）于比色管中，用純水定容到25mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程的步驟（2）（4），顯色并測(cè)定該水樣的吸光度A水樣。（2） 同時(shí)取25mL純水，代替水樣重復(fù)上述操作，獲得試劑空白的吸光度（同標(biāo)準(zhǔn)曲線

10、中的1號(hào)比色管）。將樣品吸光度A水樣扣除試劑空白的吸光度（同時(shí)要考慮校正Ac），得到樣品的校正吸光度A水樣。*操作步驟比色皿校正（Ac）將4個(gè)比色皿注入純水，以其中1個(gè)為參比溶液，測(cè)定其他3個(gè)比色皿的吸光度Ac。若Ac不等于0，在計(jì)算結(jié)果時(shí)，應(yīng)從對(duì)應(yīng)的樣品讀數(shù)中減去Ac 值。*操作步驟渾濁吸光值的測(cè)定若水樣不經(jīng)預(yù)處理，直接進(jìn)行比色測(cè)定，為了得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，需 要進(jìn)行渾濁吸光度的測(cè)定。其方法是：取適量（與測(cè)定水樣時(shí)保持一致） 水樣于比色管中，用純水定容到25mL，加入0.5mL磺胺溶液和0.5mL純水，混勻。放置顯色15min后，測(cè)定吸光度At。在計(jì)算結(jié)果時(shí)，應(yīng)從對(duì)應(yīng)的樣品讀數(shù)中減去At值。

11、實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定結(jié)果與計(jì)算1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和求算回歸方程：采用相應(yīng)軟件（如Excel）處理標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)并繪圖，橫坐標(biāo)為亞硝酸氮濃度（mg/L），縱坐標(biāo)為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正吸光度Ai，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為通過(guò)原點(diǎn)的直線，同時(shí)可求得直線回歸方程：= brAmg/LNO- -N22. 計(jì)算含量： 水樣中亞硝酸氮含量可按下式計(jì)算：A25.0r= 水樣mg/LNO- -NbV2mL水樣或在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出亞硝酸氮含量。實(shí)驗(yàn)五、水中亞硝酸氮的測(cè)定亞硝酸鹽氮的快速測(cè)定法固體試劑法以重氮化偶合比色法為基礎(chǔ)，采用固體試劑和試紙法，可以快速測(cè)定水體中亞硝酸鹽氮的含量。固體試劑法的靈敏度和準(zhǔn)確度都較高，且試

12、劑可長(zhǎng)期貯存使用。試紙法操作更為簡(jiǎn)便， 但靈敏度和準(zhǔn)確度較差。兩種方法都可為野外的工作帶來(lái)極大的方便。1. 固體試劑：將對(duì)氨基苯磺酸鹽酸奈胺酒石酸（105烘干2h）按10189的比例，充分磨細(xì)混合，裝瓶蓋嚴(yán)，可久藏不變。2. 標(biāo)準(zhǔn)色階的制備：取刻度和高度都相同的10mL比色管，參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法，分別加入一系列的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)使用液，用純水稀釋至刻度，分別加入固體試劑約40mg，搖勻，放置10min后，將所呈顏色印制下來(lái)，則得標(biāo)準(zhǔn)色階。3. 水樣測(cè)定：取水樣10ml與同樣的比色管中，加固體試劑約40mg，搖勻放置10min，與標(biāo)準(zhǔn)色階比色。取與標(biāo)準(zhǔn)色階相似的濃度即可求得水中亞硝酸鹽氮的含量

13、。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定目的要求 1掌握納氏比色法或靛酚藍(lán)法測(cè)定水中氨氮的原理和操作方法。2. 利用所學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)以及基本操作和實(shí)驗(yàn)方法，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本方法。*3. 了解氨氮測(cè)定的水樣預(yù)處理方法及蒸餾分離裝置的安裝和使用方法，目的是適應(yīng)養(yǎng)殖廢水的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定概述氨氮亦稱總氨氮，常用NH3-N表示。氨氮主要以游離氨NH3和銨鹽NH4+的形式存在于水中，兩者的組成比取決于水的pH和水溫。正常情況下， 海水中氨氮的含量一般在0.550g/L，但在深層缺氧的水中，可高達(dá)1.5mg/L。淡水中的變化幅度則較大。一般認(rèn)為，氨氮對(duì)水生生物具害作用，但真正構(gòu)成的主要是非離子氨（NH3）

14、。過(guò)高含量的NH3會(huì)損害水生生物的重要器官，抑制其生長(zhǎng)發(fā)育，甚至造成死亡。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，及時(shí)監(jiān)測(cè)水中氨氮的含量十分必要。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定方法選擇氨氮的測(cè)定通常有納氏試劑法、靛酚藍(lán)法（苯酚-次氯酸鹽）、氣相分子吸收法、次溴酸氧化法和電極法等。納氏試劑法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，目前在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。水中鈣、鎂、鐵等金屬離子、硫化物、醛、酮類、以及水中色度和混濁等會(huì)干擾本法的測(cè)定，需要作相應(yīng)的預(yù)處理。在測(cè)定海水時(shí)直接顯色易發(fā)生混濁，需要調(diào)整水樣或試劑用量。海水氨氮監(jiān)測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法，推薦的是靛酚藍(lán)法和次溴酸氧化法。次溴酸氧化法靈敏度很高、反應(yīng)快速、簡(jiǎn)便，但是只適用于清潔海水

15、。對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體，常常因?yàn)槭艿竭€原性物質(zhì)的干擾而使測(cè)定數(shù)據(jù)不穩(wěn)定、誤差較大。靛酚藍(lán)法靈敏度略低、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，但結(jié)果比較穩(wěn)定。電極法通常不需要對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理，且測(cè)量濃度范圍寬，但是含量低時(shí)誤差大，且需要購(gòu)置專用的選擇性電極和離子計(jì)。氣相分子吸收法比較簡(jiǎn)單，使用專用儀器或原子吸收儀都可達(dá)到良好的效果。氨氮含量高時(shí)，可采用蒸餾滴定法，但一般養(yǎng)殖水體達(dá)不到這一高水平。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定納氏試劑法原理納氏試劑是碘化鉀的強(qiáng)堿性溶液，它能與氨氮反應(yīng)生成棕色的難溶絡(luò)合物，濃度很小時(shí)，在水中以膠態(tài)形式存在，呈現(xiàn)為橙黃色。反應(yīng)如下式所示：以膠體狀態(tài)分散在水中的絡(luò)合物，在波長(zhǎng)420nm處， 濃度低于15

16、0mol/L(以N計(jì))范圍內(nèi)，其吸光度與氨氮含量成正比。水樣中的Ca2+、Mg2+和鐵離子能與試劑中的強(qiáng)堿作用產(chǎn)生沉淀，對(duì)測(cè)定有干擾，預(yù)加酒石酸鉀鈉可以避免沉淀的生成。本法的最低檢出濃度為0.025mg /L 測(cè)定上限為2mg/L。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定主要儀器分光光度計(jì)及配套比色皿、25mL具塞比色管、容量瓶、移液管等試劑以下試劑均使用分析純?cè)噭┘盁o(wú)氨純水配制。1. 無(wú)氨純水：可按下列方法之一制備，操作必須在無(wú)氨污染的清潔房間內(nèi)進(jìn)行：（1） 離子交換法：純水通過(guò)強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（氫型）柱， 將流出水收集在配有密封磨口塞的玻璃瓶中。每升流出水中加入10g同樣的樹(shù)脂以利于保存。（2） 蒸煮

17、法：吸取1ml硫酸至1000ml純水中加1ml堿性混合液（15gNaOH和15gNa2CO3溶于100ml水中），在燒杯中煮沸蒸發(fā)至原來(lái)體積的一半，用少許HCl中和。（3） 蒸餾法：吸取2ml濃硫酸和少量高錳酸鉀至1000ml純水中， 在全玻璃裝置中再蒸餾。棄去最先蒸出的50ml餾出水，然后將餾出水收集在配有密封磨口塞的玻璃瓶中，每升餾出水中加入約10g強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定2納氏試劑：可選取下列任一種方法制備：（1） 稱取16g氫氧化鈉（NaOH），溶于50ml水中，冷卻至室溫。另稱取7g碘化鉀（KI）和10g碘化（HgI2），溶于水中， 然后將此溶液在攪拌下，緩慢地

18、加入氫氧化鈉溶液中，并稀釋至100ml。貯于棕色瓶?jī)?nèi)，用橡皮塞塞緊。于暗處存放，有效期可達(dá)一年。（2） 稱取15g氫氧化鉀（KOH），溶于50ml水中，冷至室溫。另稱取5g碘化鉀（KI），溶于10ml水中，在攪拌下，分次少量加入二氯化（HgCl2）粉末（約2.5g），直到溶液呈深黃色或出現(xiàn)的朱紅色沉淀溶解緩慢時(shí)，改為滴加二氯化飽和溶液， 直到出現(xiàn)的少量朱紅色沉淀不再溶解，此時(shí)停止滴加。在攪拌下，將已經(jīng)放冷的氫氧化鉀溶液緩慢地加入到上述二氯化和碘化鉀的混合液中，并稀釋至100ml，于暗處?kù)o置24h， 將上清液貯于棕色瓶中，用橡皮塞塞緊存放暗處備用。*注：納氏試劑配制注意事項(xiàng)：碘化（HgI2）和碘

19、化鉀（KI）的理論比為1.371.00，當(dāng)KI過(guò)量時(shí)，可引起靈敏度降低。堿液溫度較高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生離子沉淀，因此堿液應(yīng)充分冷卻。納氏試劑產(chǎn)生大量沉淀，影響試劑的靈敏度和比色的再現(xiàn)性，使用時(shí)僅取用上清液。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定3酒石酸鉀鈉溶液（500g/L）：稱取50g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O64H2O），溶于120ml水中，加熱煮沸、蒸發(fā)濃縮至100ml，以去除氨，充分冷卻后保存。 4氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.000mg/ml：稱取3.8190.004g氯化銨（NH4Cl，在100105干燥2h），溶于水中，移入1000ml容量瓶中，稀釋至刻度。5. 氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液10.00mg/ml：移取1.

20、00ml 氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于100ml容量瓶中，稀釋至刻度。加入2ml氯仿，儲(chǔ)于冰箱中備用。臨用前配制。實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）取8支25mL具塞比色管，分別按下表的量加入氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液（Vs ），加無(wú)氨純水至標(biāo)線，混勻。水樣至標(biāo)線（25ml）。（2） 各管分別加入酒石酸鉀鈉溶液0.5mL，混勻。（3） 各管分別加入0.5mL納氏試劑，混勻后讓其反應(yīng)10min顯色。（4） 在波長(zhǎng)420nm處，用10mm比色皿，以無(wú)氨純水作參比，測(cè)定吸光度Ai。（5） 以上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的吸光度Ai扣除試劑空白（1號(hào)管）的吸光度，得到校正吸光度Ai。以校正吸光度Ai為縱坐標(biāo)，繪

21、制吸光度對(duì)氨氮濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2水樣測(cè)定取適量處理后的澄清水樣（V水樣）于比色管中，定容至25mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過(guò)程中的步驟（2）-（4），顯色并測(cè)定該水樣的吸光度A水樣。同時(shí)取25mL無(wú)氨純水，代替水樣重復(fù)上述操作，獲得試劑空白的吸光度（1號(hào)比色管即是）。將樣品吸光度A水樣扣除試劑空白的吸光度，得到樣品的校正吸光度A水樣。管號(hào)12345678rNH -N/（mg/L）300.200.400.601.001.40水樣1水樣2VS /mL0.000.501.001.502.503.50實(shí)驗(yàn)六、 水中氨氮的測(cè)定結(jié)果與計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、求算回歸方程： 橫坐標(biāo)為氨氮濃度，縱坐標(biāo)為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正吸光度，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為通過(guò)原點(diǎn)的直線，氨氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線格式示例如圖：回歸方程：A = brNH 3 -N