1、第三章 生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù),學(xué)習(xí)目標(biāo)：,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析技術(shù),光譜分析技術(shù),靈敏、準(zhǔn)確,選擇性強(qiáng),快速、簡便,應(yīng)用范圍廣,生物化學(xué)檢驗(yàn)中最基本 和最常用的分析技術(shù),光譜分析技術(shù)分類,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),一、吸收光譜分析法,（一）分光光度法的基本原理 根據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度 根據(jù)LambertBeer定律，當(dāng)溶液層厚度單位為1c

2、m，濃度單位為1mol/L時，吸光系數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)（） 是物質(zhì)的特征性常數(shù)。在固定條件（入射光波長、溫度等）下，特定物質(zhì)的不變，這是分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定性的基礎(chǔ),第一節(jié) 光譜分析技術(shù),應(yīng)用LambertBeer定律時必須符合3個條件：,二是被測樣品必須是均勻介質(zhì),應(yīng)用LambertBeer定律時必須符合3個條件：,三是在吸收過程中，吸收物質(zhì)之間不能發(fā)生相互作用,一是入射光必須為單色光,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),8,LambertBeer定律的偏離現(xiàn)象：,溶液本身發(fā)生化學(xué)變化引起的偏離,儀器因素引起的偏離,溶液不是稀溶液時會引起偏離,非單色入射光會引起偏離,光的散射、折射引起的偏離,第一節(jié)

3、光譜分析技術(shù),9,樣品空白,溶劑空白,不顯色空白,平行操作空白,試劑空白,當(dāng)顯色劑及其它試劑均無色，被測試樣中又無其他有色粒子時，選用空白溶劑參比,當(dāng)樣品基體溶液有顏色，而顯色劑無顏色且顯色劑也不與樣品基體顯色時，選用樣品空白,當(dāng)顯色劑和被測試樣均有顏色時，選用不顯色空白,與樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測元素的樣品溶液進(jìn)行平行操作,當(dāng)顯色劑或其它試劑有顏色，而被測試樣中又無其他有色粒子時，選用試劑空白參比,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),10,（二）分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用 1.對未知化合物進(jìn)行定性分析 2.對待測物質(zhì)進(jìn)行定量測定 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 （2）比較法 （3）其它分析方法,一、吸收

4、光譜分析法,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系 待測溶液測定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點(diǎn)： 當(dāng)測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品、更換光電池或光源以及試劑批號不同時），標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重新繪制 標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制必須準(zhǔn)確 當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定 標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致 標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍須足夠大，應(yīng)達(dá)到觀察拐點(diǎn),第一節(jié) 光譜分析技術(shù),（二）比較法,Cx=(AxCs)/As,己知濃度的標(biāo)

5、準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白， 同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn) 品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：,其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn) 管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量 和標(biāo)本管濃度相近,（三）其它分析方法 包括差示法、多組分混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),二、發(fā)射光譜分析法,分子、原子或離子在輻射能的作用下，由基態(tài)或低能態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)它們返回基態(tài)或低能態(tài)時，以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜,發(fā)射光譜,（一）火焰光度法,（二）熒光分光光度法,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),15,火

6、焰光度法基本原理：指在一定條件下，以火焰作為激發(fā)源提供熱能，使樣品中待測元素原子化，由于原子能級的變化，產(chǎn)生特征的發(fā)射譜線 火焰光度法臨床應(yīng)用：主要用于血清及尿液樣品中鈉、鉀的測定,特征輻射,基態(tài)元素M,激發(fā)態(tài)M*,熱能（火焰）,E,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),熒光光譜基本原理：熒光是分子吸收光能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷返回基態(tài)時所發(fā)射出的光,熒光光譜臨床應(yīng)用：大量具有生物意義的物質(zhì)，都可采用熒光分光光度法進(jìn)行分析測定，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、酶和輔酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、維生素等,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),17,三、散射光譜分析法,利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴?qiáng)度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進(jìn)行定量

7、分析的方法,散射光譜分析法,（一）散射比濁法,（二）透射比濁法,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),18,散射比濁法基本原理：一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時，遇到抗原抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物顆粒大小和多少密切相關(guān)，光強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比,透射比濁法基本原理：當(dāng)光線通過一定體積的溶液時，由于溶液中存在顆粒（抗原抗體復(fù)合物）對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，透射光的透光率和粒子的量成反比。通過測定透射光的透光率來反映粒子的量的方法即透射比濁法,三、散射光譜分析法,第一節(jié) 光譜分析技術(shù),第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),

8、利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測定化學(xué)電池的電流、電位、電導(dǎo)、電量等物理量的變化，從而測定物質(zhì)組成及含量的分析方法,電化學(xué)分析技術(shù),靈敏、準(zhǔn)確,儀器簡單,快速、簡便,價格低廉,它是電化學(xué)和分析化學(xué)學(xué)科的重要組成部分,21,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),22,電位分析法基本原理：利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法，表示電極電位的基本公式是Nernst方程式 電極電位測量：由于單個電極電位的絕對值無法測量，必須將ISE與參比電極共同浸入待測樣品中組成一個原電池，通過測量原電池電動勢（E電池）來測定EISE值 參比電極：通常為負(fù)極，常用的有甘汞電極和銀氯化銀電極，其電極電位不隨測定溶液和濃度變化

9、而變化,一、電位分析法,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),23,ISE基本結(jié)構(gòu) 電極腔體：玻璃或高分子聚合物材料做成 內(nèi)參比電極：通常為Ag/AgCl電極 內(nèi)參比溶液：由氯化物及響應(yīng)離子的強(qiáng)電解質(zhì)溶液組成 敏感膜（電極膜）,離子選擇性電極分析法(ion selective electrode，ISE)是電位分析法中發(fā)展最為迅速、最為活躍的分支,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),離子選擇性電極的分析方法：,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),直接法指樣品不經(jīng)稀釋直接由電極測量離子活度 優(yōu)點(diǎn)是可采用全血測定，它迅速方便，結(jié)果準(zhǔn)確，不會因血清中水體積所占比例的改變而影響結(jié)果,間接法指樣品經(jīng)一定離子強(qiáng)度緩沖溶

10、液稀釋后由電極測量離子活度 優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少；由于樣品預(yù)先進(jìn)行稀釋，不易堵塞管道；降低了血脂、不溶性蛋白質(zhì)對電極的污染及損耗，使電極的壽命延長,樣品測定方法：,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),離子選擇性電極對任何標(biāo)本的測量，都可能存在離子強(qiáng)度、絡(luò)合劑及干擾物質(zhì)的影響，不同的分析方法其影響的大小不同 通常在標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)本溶液中加入與待測離子無干擾的濃度較大的電解質(zhì)溶液，作為總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖液（total ionic strength adjustment buffer，TISAB） TISAB可保持較大且相對穩(wěn)定的離子強(qiáng)度，使活度系數(shù)恒定；維持溶液在適宜的pH范圍內(nèi)，滿足離子電極的要求；還能掩蔽干擾離

11、子,電極分析法的影響因素：,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),電極分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用電解質(zhì)分析儀,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),二、電導(dǎo)分析法,將被分析溶液放在固定面積、固定距離的兩個電極所構(gòu)成的電導(dǎo)池中，通過測定電導(dǎo)池中電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來確定物質(zhì)的含量,電導(dǎo)分析法,檢測紅細(xì)胞壓積 紅細(xì)胞由于其具有脂質(zhì)雙分子層的膜結(jié)構(gòu)而被認(rèn)為是電的絕緣體,血細(xì)胞計數(shù) 其原理基于血細(xì)胞的電導(dǎo)率低于作為懸浮介質(zhì)的鹽溶液的電導(dǎo)率（“庫爾特原理”）,應(yīng)用,第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),三、電容量分析法,根據(jù)滴定過程中電極電位的變化來確定滴定終點(diǎn)的分析方法。滴定過程中，隨著滴定劑的加入，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，待測離子

12、或與之有關(guān)的離子活度（濃度）發(fā)生變化，指示電極的電極電位（或電池電動勢）也隨著發(fā)生變化，在化學(xué)計量點(diǎn)附近，電位（或電動勢）發(fā)生突躍，由此確定滴定的終點(diǎn),電容量分析法,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),指將液態(tài)樣品如血漿、血清、尿液等置于含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測定樣品中特定成分的濃度或活度的一項技術(shù),干化學(xué)分析,是一種專門使用固相載體試劑進(jìn)行臨床化學(xué)檢驗(yàn)的分析儀，它通過反射光度法、差示電位法等方法定量測出樣品中特定成分的濃度或活度,干化學(xué)分析儀,33,干化學(xué)技術(shù)普遍采用多層膜固相試劑技術(shù)，即干式化學(xué)的多層膜試劑載體，它集中現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程學(xué)、化學(xué)計量學(xué)和計

13、算機(jī)技術(shù)于一體，已使其作為定量方法,一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),34,理論基礎(chǔ)：遵從Kubelka-Munk理論 光反射率與固相層的厚度、單位厚度的光吸收系數(shù)以及固相反應(yīng)層的散射系數(shù)有關(guān)系，當(dāng)固相層厚度和固相反應(yīng)層的散射系數(shù)固定時，光吸收系數(shù)同待測物的濃度成正比,（一） 反射光度法,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),35,多層膜干片結(jié)構(gòu) （1）樣本擴(kuò)散層 （2）反射層 （3）輔助試劑層 （4）試劑層 （5）透明支持層,基于反射光度法的多層膜干片結(jié)構(gòu)示意圖,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),基于傳統(tǒng)濕化學(xué)分析的離子選擇電極原理，用于測定無機(jī)離子,（二） 差示電位法,多層膜結(jié)構(gòu) （1）離子選擇性敏

14、感膜（2）參比層 （3）氯化銀層 （4）銀層 （5）支持層,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),37,干化學(xué)自動分析儀已廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的各個方面，檢測的項目已多達(dá)70余項，包括常規(guī)生化、內(nèi)分泌激素、毒素、藥物濃度分析以及特種蛋白等免疫學(xué)檢驗(yàn),二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),38,干化學(xué)分析法的特點(diǎn)：,速度快，靈敏度和準(zhǔn)確度與典型的分離式儀器相近,應(yīng)用LambertBeer定律時必須符合3個條件：,超微量，操作簡單，占用空間小，使用過程中靈活機(jī)動性強(qiáng),脫離了傳統(tǒng)的分析方法，所有的測定參數(shù)均存儲于儀器的信息磁場塊中,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),39,干化學(xué)和濕化學(xué)生化檢測的主要區(qū)別,第

15、三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),40,1.儀器監(jiān)測 2.校準(zhǔn)頻度 3.質(zhì)控物 4.干片試劑的儲存與使用 5.工作環(huán)境溫度和濕度,三、干化學(xué)分析技術(shù)的影響因素,第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù),第四節(jié)電泳分析技術(shù),第四節(jié)電泳分析技術(shù),1937年瑞典的Tiselius創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，最早建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法 1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法 1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)

16、建了聚丙烯酰胺凝膠電泳 由80年代發(fā)展起來的新的毛細(xì)管電泳技術(shù) 由90年代至今，電流分析儀的最大變化特點(diǎn)為自動化程度日益提高，應(yīng)用領(lǐng)域大大增加,一、電泳分析技術(shù)的基本原理,溶液中帶電粒子在電場中定向移動的現(xiàn)象稱為電泳,電泳,第四節(jié)電泳分析技術(shù),(一) 蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn),蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）： 如果在某一pH值溶液中，蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷相等，即蛋白質(zhì)的凈電荷為零，蛋白質(zhì)電離為兼性離子時，該溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點(diǎn),粒子的荷電量可以通過調(diào)節(jié)pH值與pI之間的差值加以控制，差值越大，粒子荷電量越多,第四節(jié)電泳分析技術(shù),(二) 電泳遷移率,電泳遷移率是指在單位電場強(qiáng)度時帶電粒子的遷移

17、速度,帶電粒子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個粒子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離,遷移率與帶電粒子所帶凈電荷成正比，與粒子的大小和緩沖液的黏度成反比,第四節(jié)電泳分析技術(shù),血清蛋白等電點(diǎn)和電泳遷移率,第四節(jié)電泳分析技術(shù),(三) 影響電泳的因素,第四節(jié)電泳分析技術(shù),支持介質(zhì)的電滲作用,第四節(jié)電泳分析技術(shù),二、常用電泳分析技術(shù)及應(yīng)用,第四節(jié)電泳分析技術(shù),以醋酸纖維素薄膜作為支持介質(zhì)的一項電泳技術(shù),以瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一項電泳技術(shù),利用有pH梯度的介質(zhì)

18、分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù),以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一項電泳技術(shù),聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳,醋酸纖維素薄膜電泳,等電聚焦電泳,按電泳 支持物分類,第四節(jié)電泳分析技術(shù),二、常用電泳分析技術(shù)及應(yīng)用,1.醋酸纖維素薄膜電泳,優(yōu)點(diǎn)：醋酸纖維素幾乎不帶電荷，吸附作用和電滲作用都很微弱；分辨率高，區(qū)帶清晰；不吸附染料，區(qū)帶周圍染料可完全漂洗干凈；極易透明，便于區(qū)帶掃描定量；透明后的薄膜易于干燥，電泳區(qū)帶可長期保存,缺點(diǎn)：吸水性較差，較脆，電泳時水分容易蒸發(fā)。因此要求電泳槽密閉性能要好，始終維持水蒸氣飽和，電流強(qiáng)度不宜過大，一般保持在0.40.6mA/cm寬為宜,第四節(jié)電泳分析技術(shù),2

19、.瓊脂糖凝膠電泳,優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖凝膠透明度好，便于區(qū)帶掃描。適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化，在臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的檢測,缺點(diǎn)：電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時固定,第四節(jié)電泳分析技術(shù),3.聚丙烯酰胺凝膠電泳,優(yōu)點(diǎn)： 1.既有電荷效應(yīng)又有分子篩效應(yīng)，分離效果好 2.化學(xué)穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體 3.幾乎沒有吸附和電滲作用 4.機(jī)械強(qiáng)度好，無色透明，可直接光密度掃描 5.可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離,第四節(jié)電泳分析技術(shù),4.等電聚焦電泳,是利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù),等電聚焦（isoelectric focusing，IEF

20、）,優(yōu)點(diǎn)： IEF是一種簡便、快速、高效的分離分析方法，特別適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶類和抗體等的分離分析，能夠滿足組分定量、雜質(zhì)檢出、質(zhì)量控制、臨床診斷等方面的要求,第四節(jié)電泳分析技術(shù),(三) 電泳區(qū)帶的測定,第四節(jié)電泳分析技術(shù),(三) 電泳區(qū)帶的測定,1.區(qū)帶定性分析主要觀察有無異常區(qū)帶出現(xiàn) 2.區(qū)帶定量分析區(qū)帶定量分析常用光密度掃描法或洗脫比色法,第四節(jié)電泳分析技術(shù),三、自動電泳儀分析技術(shù),自動電泳儀的電泳過程，包括加樣遷移染色去色烘干，都依次按程序自動進(jìn)行,第四節(jié)電泳分析技術(shù),第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù),第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序

21、列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。能使人們在幾小時內(nèi)從試管中獲得大量的特異的核酸片段。臨床實(shí)驗(yàn)室主要用于對病毒、細(xì)菌、支原體及其它病原體的檢測,一、PCR反應(yīng)基本原理,2.退火（annealing） 即在較低的溫度(4070)下使加入的引物與待擴(kuò)增的DNA區(qū)域特異性結(jié)合，以提供DNA復(fù)制起始的3-OH端,3.延伸（extension） 即在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?075），DNA聚合酶特異性結(jié)合到DNA模板上的引物的3-OH端，以dNTP為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，進(jìn)行DNA鏈的延伸，即合成DNA新鏈,1.變性（denature） 通過加熱至95左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成DNA單鏈模板而游離于反應(yīng)體系中，此過程稱為變性,第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù),61,上述3個步驟反復(fù)循環(huán)，使得特定長度的靶DNA數(shù)量呈指數(shù)上升。在理論上，終產(chǎn)物DNA的量可用Yn=X2n計算,第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù),模板就是被復(fù)制的核酸片段,引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，為化學(xué)合成的寡核苷酸,可穩(wěn)定核苷酸和提高Taq DNA聚合酶的活