1、研究細胞生命活動的完整解決方案 -細胞凋亡,BD公司 李彩霞Caixia_,一個細胞的全面研究,BD 提供的技術方法,Flow Cytometry (FCM) Immunophenotyping Cytometric Bead Array (CBA System for multiplexed Immunoassays) Phosflow (cell signaling) ELISA (BD OptEIA) ELISPOT Cell Separation (BD Imag) Western Blots (WB) Immuno-Precipitation (IP) Im

2、muno-HistoChemistry (IHC) Immuno-Fluorescence (IF) direct link with BioImaging Function Assays (FA) Molecular Biology (MB) Protein Expression (BD Baculovirus Expression Vector) mRNA Detection (BD RiboQuant),Life and Death of the Cell,外在因素,內(nèi)在因素,分裂-細胞增殖,分化,維持現(xiàn)狀,壞死,凋亡,細胞凋亡概述,細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有

3、序的死亡。 細胞凋亡參與正常組織發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)過程。 病理狀態(tài): 癌癥 (正常的凋亡發(fā)生改變/下降） 神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病和Alzheimers 疾病 病毒性疾病如 HIV 自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎,細胞凋亡研究方法,研究方法: 流式細胞儀 酶聯(lián)方法 圖像 組織化學 基于DNA的方法 BD Pharmingen 有500多種研究凋亡的試劑: 抗體（針對凋亡蛋白） 試劑盒 抑制劑,細胞凋亡研究指標,細胞凋亡研究指標,凋亡相關細胞膜變化的檢測 凋亡相關酶活性的檢測 凋亡相關線粒體變化的檢測 凋亡相關DNA片段的檢測,Annexin V 檢測-細胞膜變化相關檢測,表面 marker 檢測細

4、胞膜的變化，與凋亡正相關 早期、快速確定凋亡的方法 需要用活的、沒有固定的細胞 方法 流式細胞術 免疫熒光技術,Annexin V 檢測原理,Annexin V Data,BD Annexin V 流式試劑盒,提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多種熒光標記的Annexin V以及純凈的Annexin V。,Annexin V檢測常見問題,是否 Annexin V kits 可以檢測小鼠或其他物種? Annexin V試劑盒可以檢測多種屬 這個試劑盒是否可用于貼壁細胞、固定或凍存的細胞、或組織? No. 上述樣

5、本的細胞細胞膜都會或多或少受到損害，這樣的樣本建議用免疫熒光技術 (Cat. No. 550911) 是否與細胞表面標記兼容? 只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時做.,凋亡相關酶的檢測-Caspase概述,凋亡蛋白酶是凋亡重要的起始因子。凋亡最早和最常檢測到的特征之一是一系列名為caspases的胞漿蛋白酶的激活。尤其是caspase-8、-9和-3都與凋亡有關。 Caspase-3在早期凋亡細胞中就已經(jīng)活化，是凋亡程序中的重要的Caspase酶。活化的Caspase-3又水解、活化其它Caspase酶和多種胞漿內(nèi)成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核內(nèi)成分（如PARP）。,凋亡相

6、關酶的檢測-Caspases檢測方法,胞內(nèi) markers 凋亡進行的標志 (active caspase-3) 用固定細胞 檢測方法 ELISA 免疫熒光（熒光顯微鏡） 免疫組化 免疫沉淀 Flow Cytometry Western Blot,Caspase-3 data,Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes,Caspase-3,PARP cleaved Caspase 3水解產(chǎn)物,Hela 細胞 A 未處理組 B星孢菌素處理組裂解的PARP陽性,Jurket細胞用不同濃度的喜樹堿處理結果,BD Caspase 流式檢測試劑盒,更多產(chǎn)品見Tools for ass

7、essing cell events Apoptosis, Cell Cycle, and Cell Proliferation Product list,線粒體膜電位檢測: JC-1,凋亡與線粒體膜電位的去極化相關 該染料在正常細胞中在胞漿以聚合體形式存在，在 Fl-1 和 Fl-2 有熒光 細胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1 進入線粒體以單體形式存在，僅在 Fl-1通道有熒光,BD Mitoscreen (JC-1) Data,JC-1 (Fl-1),Jurkat T Cells,Mouse Thymocytes,Control,Staurosporine,Camptothecin

8、,Fas mAb,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,R1,R2,Control,JC-1 (Fl-2),BD JC-1 試劑盒,細胞核DNA檢測,凋亡晚期 DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段 檢測方法 Tunel流式法，通過在核酸片段末端標記計算凋亡百分比 DNA Ladder分析，但凋亡細胞太少時不好做,細胞核DNA檢測原理：APO-BRDU,TUNEL法 流式分析晚期凋亡,APO-DIRECT KIT 50 tests cat. 556381,一步法 實驗用2種染料 PI染色總DNA：得到細胞周期的信息； FITC-dUTP染色凋亡細胞：檢測凋亡。 在流式細胞儀488nm激發(fā)下，PI發(fā)射約623nm熒光，F(xiàn)ITC發(fā)射520nm熒光。,TUNEL法 流式分析凋亡,APO-BrdU KIT 60 tests cat. 556405,二步法 PI染色檢測細胞周期 FITC