1、實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳,1、教學(xué)目的與要求： 學(xué)習(xí)與掌握DNA電泳的技術(shù)方法，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度、含量以及分子量，及分離不同大小DNA片段。 2、實(shí)驗(yàn)原理： 電泳概念及種類 影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素,原理,DNA 分子是兩性電解質(zhì)， 在高于其等電點(diǎn)的溶液（ pH8.0pH8.3 ）中 ，堿基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離， DNA 分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。 電泳時(shí)DNA 分子顆粒在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)而泳動(dòng)。顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快，反之則泳動(dòng)速度慢。,瓊脂糖是從海藻中提取的、由D-和 L-半乳糖殘基通過和糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物。瓊脂

2、糖鏈形成螺旋纖維，然后再聚合成半徑為20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻?，室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。,原理,瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。,凝膠濃度 DNA分子大小 DNA分子的構(gòu)象 緩沖液 電泳電壓,主要檢測(cè)：分子量，含量及有無,影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移率的因素,DNA分子的大小,雙鏈DNA分子在凝膠中遷移的速率與其堿基數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。 分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。,DNA的構(gòu)象,DNA的構(gòu)象,不同構(gòu)象DNA分子

3、在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離不同。具有相同分子量的線狀、開環(huán)狀和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度不同。 遷移速度： 超螺旋的DNA線狀DNA 開環(huán)DNA 。,瓊脂糖濃度,相同大小的線狀 DNA片斷在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移率不同. 瓊脂糖濃度(%)分離范圍（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,電泳電壓,低壓條件下，線狀DNA在瓊脂糖凝膠上泳動(dòng)速度和電壓成正比。隨著電壓升高，高分子量的DNA片段泳動(dòng)速度和電壓不成正比關(guān)系，分辯率下降了，因此為了得到良好的分離效果，電場(chǎng)電壓不要超過5V/CM。,

4、緩沖液,DNA的泳動(dòng)受緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。 最常用的緩沖也是TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。,指示劑,常用的電泳上樣緩沖液含溴酚藍(lán)，有的還含有二甲苯青，這些指示劑可以指示電泳的速度，也可以利用其遷移率大致估計(jì)DNA的分子量，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。,染色,溴化乙淀（EB）是核酸的染色劑，能插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物， EB在紫外線照射下的發(fā)射熒光。熒光的強(qiáng)度與DNA的含量成正比，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置及估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度。 EB是強(qiáng)致癌劑。,電泳操作步驟(整個(gè)過程要求帶一次性手套),1、膠槽準(zhǔn)備 取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽中

5、; 將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和板面有1mm的間隙; 將膠槽放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。,2、凝膠準(zhǔn)備 用1TAE配制1瓊脂糖凝膠。 稱0.15g瓊脂糖置三角瓶中，加15ml 1TAE; 微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖; 熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070時(shí)，加入EB 0.5l，并輕輕混勻。,3、鋪膠：將冷卻致60的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠槽內(nèi)，凝膠厚度35mm,室溫下靜置半小時(shí)左右，凝膠固化。,4、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝膠的膠板置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極，向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可。,5、原梳齒處(樣品孔)即被緩沖液充滿，如發(fā)現(xiàn)有氣泡，應(yīng)設(shè)法去除。,6、樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/10的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻。,7、上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。加樣量一般5-7l。,9、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。,8、蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳 開始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。 電