1、上機(jī)三多序列比對(duì)與分子進(jìn)化分析,教學(xué)目標(biāo),了解： 多序列比對(duì)的主要方法 基因組進(jìn)化的意義 理解： 漸進(jìn)算法的基本原理 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建步驟 掌握： 使用CLustalX、 MUSCLE進(jìn)行多序列比對(duì) 使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),資料準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,資料下載地址： 下載“上機(jī)三_多序列比對(duì)與分子進(jìn)化分析.rar” 資料內(nèi)容： 多序列比對(duì)軟件 ClustalX: clustalx-2.1-win.msi 多序列比對(duì)軟件 muscle: muscle3.6 指導(dǎo)樹(shù)查看軟件TreeView: TreeView 進(jìn)化分析軟件 MEGA4：MEGA4_setup.exe

2、MEGA使用說(shuō)明：MEGA4.1使用指南.pdf 超級(jí)文本編輯器UltraEdit32：UltraEdit-32 來(lái)自21個(gè)物種的血紅蛋白家族序列：HBA.fasta 來(lái)自13個(gè)物種的酪蛋白家族序列：CASA1.fasta,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1. 蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam的使用 2. 使用ClustalX對(duì)血紅蛋白alpha亞基家族序列HBA.fasta （HBA）進(jìn)行多序列比對(duì) 3. 使用Muscle對(duì)對(duì)血紅蛋白alpha亞基家族序列HBA.fasta （HBA）進(jìn)行多序列比對(duì) 4.使用MEGA4 ，構(gòu)建血紅蛋白alpha亞基家族HBA （21個(gè)物種）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),安裝程序,安裝ClustalX程序

3、 看看程序安裝到了何處？ 安裝指導(dǎo)樹(shù)顯示程序TreeView 解壓縮Muscle程序到本地磁盤， 如E:muscle3.6 綠色軟件，不用安裝耶！ 安裝MEGA軟件，MEGA4_setup.exe,查看序列文件,使用UltraEdit查看HBA.fasta文件： 21條血紅蛋白alpha亞基（HBA）數(shù)據(jù) 序列為fasta格式 各序列的物種來(lái)源如下：,操作一：蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam的使用,Pfam網(wǎng)址：/,Question,有一條蛋白質(zhì)序列如下： MKWVWALLLLAALGSGRAERDCRVSSFRVKENFDKARFSGTWYAMAKKDPE

4、GLFLQDNIV AEFSVDETGQMSATAKGRVRLLNNWDVCADMVGTFTDTEDPAKFKMKYWGVASFLQKGND DHWIVDTDYDTYAVQYSCRLLNLDGTCADSYSFVFSRDPNGLPPEAQKIVRQRQEELCLA RQYRLIVHNGYCDGRSERNLL,利用Pfam的搜索功能，回答： 該序列屬于哪個(gè)家族？該家族在Pfam中的編號(hào)是什么？ 該家族共同含有哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域？,進(jìn)行序列搜索,輸入序列,進(jìn)行檢索,在Pfam中進(jìn)行序列檢索,檢索結(jié)果,可以看出輸入的序列含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域Lipocalin，屬于Lipocalin家族,點(diǎn)擊這里查看Lipocal

5、in家族的詳細(xì)信息,Lipocalin家族在Pfam中的編號(hào)是PF00061,操作二：使用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì),實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?理解漸進(jìn)算法比對(duì)原理，熟悉和掌握ClustalX的使用和比對(duì)結(jié)果分析。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 使用ClastalX對(duì)血紅蛋白alpha亞基家族序列HBA.fasta （HBA）進(jìn)行多序列比對(duì),操作步驟：,1、輸入序列文件 2、設(shè)定比對(duì)參數(shù) 3、進(jìn)行比對(duì) 4、分析結(jié)果 5、使用TreeView查看指導(dǎo)樹(shù)文件,Use your mind!,獨(dú)立思考，完成上述多序列比對(duì)任務(wù) 如果遇到困難，可參考接下來(lái)的使用指導(dǎo)。,導(dǎo)入序列文件,“File” “Load Sequence”,注意

6、：序列文件要存儲(chǔ)在英文目錄下，否則會(huì)打不開(kāi),序列導(dǎo)入成功,設(shè)定一些比對(duì)參數(shù),Alignment Parameters,參數(shù)設(shè)定窗口,空位罰分,空位擴(kuò)展罰分,執(zhí)行比對(duì),Do Complete Alignment,比對(duì)結(jié)果保存,E:/data/HBA.dnd,E:/data/HBA.aln,點(diǎn)擊OK,比對(duì)結(jié)果,保守殘基,次保守殘基,結(jié)果初步分析：保守區(qū)域分析,在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索HBA.fasta中的任意一條序列，查找證實(shí)該序列含有結(jié)構(gòu)域Globin 例如將HBA.fasta中的第一條序列輸入到Pfam中進(jìn)行檢索 HBA_ACCGE MVLSANDKTNVKNVFTKIGGHAEEYGAETLE

7、RMFTTYPPTKTYFPHFDLHHGSAQIKAHGKKVVGALIEAVNHIDDIAGALSKLSDLHAQKLRVDPVNFKLLGQCFLVVVAIHHPSVLTPEVHASLDKFLCAVGNVLTAKYR,選擇保存結(jié)果文件的格式,Save Sequence as,保存比對(duì)結(jié)果的選擇項(xiàng),Clustal Format,使用TreView查看指導(dǎo)樹(shù)文件,使用TreView打開(kāi)HBA.dnd文件，查看指導(dǎo)樹(shù),注意：指導(dǎo)樹(shù)并不是嚴(yán)格意義上的進(jìn)化樹(shù),操作三：使用MUSCLE進(jìn)行多序列比對(duì),MUSCLE使用流程： 解壓縮MUSCLE到硬盤 拷貝序列文件HBA.fasta到muscle文件夾

8、內(nèi) “開(kāi)始”菜單運(yùn)行“CMD”，進(jìn)入命令行操作系統(tǒng) 命令行操作進(jìn)入到muscle目錄 運(yùn)行 muscle命令，查看參數(shù)設(shè)置說(shuō)明 進(jìn)行序列比對(duì)操作,DOS命令行操作基本命令,運(yùn)行命令“muscle”，查看使用說(shuō)明與參數(shù)設(shè)置,E:muscle3.6,MUSCLE：使用說(shuō)明,muscle -in HBA.fasta -out HBA.aln -clw,MUSCLE：使用說(shuō)明,基本操作命令： muscle -in HBA.fasta -out HBA.aln -clw,程序名稱,輸入控制 指令,輸入文件名稱,輸出控制指令,結(jié)果保存文件名稱,輸出格式控制指令,使用MUSCLE 進(jìn)行比對(duì)過(guò)程演示,注意：動(dòng)

9、畫(huà)需要放映PPT才可播放,使用UltraEdit查看比對(duì)結(jié)果,用UltraEdit打開(kāi)HBA.aln文件查看多序列比對(duì)結(jié)果,操作四 構(gòu)建血紅蛋白alpha亞基家族HBA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),MEGA4啟動(dòng)界面,第一步：導(dǎo)入序列進(jìn)行多序列比對(duì)序列HBA.fasta,Create a new alignment ：是在你沒(méi)有任何比對(duì)的時(shí)候使用，比如你只有一個(gè)fasta 格式的序列就可以選擇這個(gè)選項(xiàng)。 Open a saved alignment session：使用它可以打開(kāi)一個(gè)我們已經(jīng)比對(duì)好的序列文件； Retieve a sequence from a file ：這種情況同第一種情況相似，只是不用

10、選擇是DNA 還是蛋白質(zhì)序列比對(duì)，選擇的也是fasta 格式的文件，打開(kāi)后的界面都是一樣的。,選擇序列文件HBA.fasta，并打開(kāi),HBA序列文件打開(kāi)后的序列編輯窗口,序列編輯窗口各菜單說(shuō)明,請(qǐng)對(duì)照使用指南（MEGA4.1使用指南.pdf）了解序列編輯窗口各菜單的功能,執(zhí)行多序列比對(duì),多序列比對(duì)參數(shù)設(shè)置,比對(duì)完成，保存結(jié)果,點(diǎn)擊保存,在彈出對(duì)話框中寫(xiě)入數(shù)據(jù)的標(biāo)題，即你對(duì)數(shù)據(jù)的描述（也可不寫(xiě)） ，點(diǎn)擊OK,關(guān)閉多序列比對(duì)窗口后，導(dǎo)入比對(duì)結(jié)果,點(diǎn)擊OK導(dǎo)入比對(duì)后的序列,出現(xiàn)比對(duì)結(jié)果編輯窗口，關(guān)閉該窗口,進(jìn)化分析功能菜單在主窗口出現(xiàn)，對(duì)照使用指南了解進(jìn)化分析主窗口各菜單的基本功能,構(gòu)建帶檢驗(yàn)的MP進(jìn)化樹(shù),參數(shù)設(shè)置窗口,點(diǎn)這里開(kāi)始構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),MP一致性樹(shù),這幾個(gè)按鈕可以對(duì)樹(shù)進(jìn)行編輯,帶遺傳標(biāo)尺的進(jìn)化樹(shù),樹(shù)枝長(zhǎng)度表示遺傳距離的進(jìn)化樹(shù),鄰接法(N-J)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),N-J一致樹(shù),最小進(jìn)化法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),最小進(jìn)化一致樹(shù),算術(shù)平均非加權(quán)對(duì)群法UPGMA,它假設(shè)沿著進(jìn)化樹(shù)分支的變化速率為一個(gè)常數(shù)，而距離近似為非加權(quán)的。UPGMA 法由計(jì)算關(guān)系最近序列間的枝長(zhǎng)開(kāi)始，然后計(jì)算序列對(duì)與下一個(gè)序列