1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù),專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,1、實例：,啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的

2、環(huán)境中去尋找。,原因：因為熱泉溫度70800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物不能生長 造成有利于該菌生長的環(huán)境， 結(jié)果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實驗室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物

3、理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,1、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點,2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高

4、時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。,計數(shù)法,直接計數(shù)法、 平板

5、計數(shù)法、 比濁法、 膜過濾法,例題：統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法有 （ ）,A. B. C. D.,D,涂布平板法 重量法 直接計數(shù)法 比濁法 生理指標(biāo)法 膜過濾法,設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,.設(shè)置對照：,實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A

6、同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,二.實驗的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目

7、的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板,三樣品的稀釋,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說

8、明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,三.結(jié)果分析與評價 1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個平板上長有30300個

9、菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。,四、操作提示,無菌操作,做好標(biāo)記,規(guī)劃時間,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,本課題知識小結(jié):,例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的

10、時期是 A調(diào)整期 B對數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期,解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時的微生物的生存斗爭主要是與無機環(huán)境的斗爭。,答案：C,1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接

11、種一種細(xì)菌 C.接種一個細(xì)菌 D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時代的意義。 青霉素發(fā)