1、農(nóng)桿菌介導甜菜遺傳轉化技術規(guī)程編制說明一、工作簡況根據(jù)國家糖料產(chǎn)業(yè)技術體系任務要求及內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)管局關于下達2019年第2批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知（內(nèi)市監(jiān)標準字2019300號）文件精神，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院提出并負責農(nóng)桿菌介導甜菜遺傳轉化技術規(guī)程地方標準的起草工作。主要起草人：張自強，白晨，李曉東，張惠忠，王良，韓平安，張必周，付增娟，趙尚敏，鄂圓圓，鄭文哲，張輝。二、制定本標準的必要性和意義甜菜是世界上重要的糖料作物之一，也是我國第二大糖料作物。然而，甜菜播種、收獲季節(jié)性強，人工作業(yè)存在勞動強度高、效率低、收獲損失大和占用農(nóng)時多等問題，這些問題制約了甜菜產(chǎn)業(yè)進

2、一步發(fā)展。實現(xiàn)甜菜生產(chǎn)機械化，使甜菜生產(chǎn)從分散型向集約型轉變，不僅有利于提高生產(chǎn)率、節(jié)約勞力和降低勞動強度，也是甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然出路。隨著甜菜機械化作業(yè)程度的不斷提高，特別是大規(guī)模集約化生產(chǎn)的不斷推進，甜菜生產(chǎn)中病蟲草害越來越重，特別是草害的防控，通過育種和人工除草不能完全解決問題，只能通過化學除草，然而甜菜對除草劑又是特別敏感的作物，故而甜菜的草害已經(jīng)嚴重制約了我國甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過本標準建立農(nóng)桿菌介導轉化甜菜的技術，培育出抗除草劑（草甘膦）的甜菜品種，將使得滅生性除草劑可以在甜菜地里應用，有效的解決甜菜生產(chǎn)機械化作業(yè)后的除草問題，方便進行田間管理，極大的解放勞動力，降低甜菜種植成本，對

3、于提高甜菜產(chǎn)量和品質(zhì)，增加農(nóng)民收入，促進我國甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應用前景。三、本標準的起草過程近年來，我們在國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系和內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項“甜菜生物技術育種體系研究與應用”項目的專項資金支持下，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院特色作物研究所開展農(nóng)桿菌介導轉化甜菜的試驗，經(jīng)過多年大量的試驗，內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院特色作物研究所對試驗結果進行了集成與組裝，編制形成了“規(guī)程”草案。四、本標準主要技術指標確定的依據(jù)主要技術指標來源于20082018年在內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)科院進行的農(nóng)桿菌侵染液的制備試驗、甜菜無菌苗葉片-葉柄預培養(yǎng)試驗以及農(nóng)桿菌侵染甜菜葉片-葉柄試驗等試驗

4、結果。五、主要條款的說明本標準的主要內(nèi)容包括以下四項：（1）侵染液的制備：將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌刮下來，放置侵染液培養(yǎng)基中重新懸浮，使其OD600值在0.300.50之間，然后冰浴1 h，備用。（2）外植體的準備：外植體葉片-葉柄放進行預培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。預培養(yǎng)時間2 d6 d。預培養(yǎng)后的葉片-葉柄，沿其莖走向用手術刀劃出傷口，傷口的深度以不切透葉片-葉柄為準。（3）農(nóng)桿菌侵染方法：處理后的葉片-葉柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使葉片-葉柄完全浸入侵染液，侵染20 min30 min。（4）侵染后外植體培養(yǎng)條件：共培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，暗培養(yǎng)

5、，培養(yǎng)時間3 d6 d；脫菌培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境：搖床轉速125 rpm，溫度25 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h，培養(yǎng)2 d3 d；篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境：培養(yǎng)條件：溫度25 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。六、重大意見分歧的處理依據(jù)和結果無。七、采用國際標準和國外先進標準的，說明采標程度，以及國內(nèi)外同類標準水平的對比情況無。八、其他應說明的事項無。九、標準草稿征求意見情況匯總表序號意 見提出單位/專家采納不采納（說明原因）1各個激素首次出現(xiàn)應該給出中文名稱，如NAA（萘乙酸），因為后面4.4-4.9激素均用的中文名稱。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納2pH=5.8，改為pH=5

6、.8，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納3農(nóng)桿菌感受態(tài)類型、拉丁文應標出內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納4改為：將生長過夜的農(nóng)桿菌刮下，放置侵染液培養(yǎng)基中混勻放在搖床上，溫度 28 ，轉速 75 rpm100 rpm，搖 2 h4 h，使其OD600值在0.300.50之間，備用。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納5抽出容器中空氣，制造真空環(huán)境，改為：使用真空泵抽真空，使葉片-葉柄完全浸入侵染液。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納6改為：從侵染液中取出葉片-葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納7改為：脫菌 2 d3 d后，因上面8.4是培養(yǎng) 2 d3 d。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學

7、/史樹德采納8使用濃度為 1.2 ml/L的草甘膦溶液，該濃度是大田除草時使用濃度？說明一下較好內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學/史樹德采納9該標準提出了遺傳轉化所需的一系列培養(yǎng)基制備、種球的的消毒技術及無菌苗的培養(yǎng)過程、外植體的制備、農(nóng)桿菌的制備、侵染及遺傳轉化過程、再生苗的篩選和目的基因的檢測等過程。該標準即體現(xiàn)了農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉化的共性，也反映了甜菜遺傳轉化的特殊性。該標準的建立為抗除草劑甜菜的培育和有效的解決甜菜生產(chǎn)機械化作業(yè)后的除草問題提供了基礎。不足之處：該標準里沒有體現(xiàn)轉化率。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/斯欽巴特爾采納10建議該部分改為“4 培養(yǎng)基配制”內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納11該部分中滅菌

8、水與無菌水是否為同一物質(zhì)，若為同一物質(zhì)，建議全文統(tǒng)一，若為不同物質(zhì)，在5.1 滅菌前準備進行交代。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納12該部分“1 M，pH=5.8，”多一個逗號，建議全文檢查。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納13種球萌發(fā)過程的培養(yǎng)環(huán)境是否也對光照強度、時間等有要求，若有需交代，或者與接種到新的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)環(huán)境是否一致，如果一致可統(tǒng)一交代，若不同，上下表述的格式應一致。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納14該兩條內(nèi)容中表述為“培養(yǎng)條件”5.3中則表述為“培養(yǎng)環(huán)境”，建議全文統(tǒng)一。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納15該條中表述為“培養(yǎng)過夜”，建議對培養(yǎng)時間進行準確表述。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院/郭曉霞采納16該3條中表述為“培養(yǎng)2 d-3 d”、“大約15 d”、“20 d左右即可誘導出新生根”，標準中其余類似表述均為“培養(yǎng)時間為”,建議全文檢查，