基因芯片技術在心血管研究中的應用,綠色包裝與生物納米技術實驗室,1,第一節(jié) 基因芯片技術概論,一、基因芯片技術的產生和發(fā)展二、基因芯片技術概論三、基因芯片制備技術四、基因芯片的檢測方法,2,一、基因芯片技術的產生和發(fā)展,1986 Dulbecco在Science撰文 “腫瘤研究的轉折點:人類基因組的測序”，提出全面解讀人類基因組序列。1990.10 美國國家衛(wèi)生研究機構率先啟動人類基因組計劃 實驗方法和技術的產生 2003.4 人類基因組計劃完成 后基因組時代,3,傳統(tǒng)的方法：效率太低，無法滿足后基因組研究的要求高效研究成千上萬基因的功能需要高效的方法和工具,4,生物芯片技術始于20世紀80年代后期，將八聚體寡核苷酸探針固定在尼龍膜上進行雜交， 但由于核酸在尼龍膜上容易擴散，因此在單位面積上的點樣密度受到限制。同時濾膜面積較大而需要較多的探針量，故檢測靈敏度較低，為了提高點樣密度和靈敏度，降低探針用量，人們逐漸發(fā)現(xiàn)以玻璃、硅片等材料比傳統(tǒng)的膜載體有無法比擬的優(yōu)點，因此以此為材料的DNA芯片技術應運而生。,基因芯片發(fā)展歷史,5,1991年，美國Affymetrix公司在玻璃片上原位合成世界上第一張寡核苷酸基因芯片。1995年，Stanford大學的P.Brown實驗室發(fā)明了第一塊以玻璃為載體的世界上第一張直接點樣法制備的cDNA芯片。,基因芯片發(fā)展歷史,6,1996 Chee et al：DNA測序1996 Cronin et al：突變檢測1996 Sapolsley & Lipshutz：基因圖克隆1996 Shalon et al：復雜DNA樣本分析1996 Shoemaker et al：缺省突變定量表型分析目前擴展的方法，包括蛋白芯片、組織芯片等,7,乳腺癌診斷組織芯片,蛋白質芯片示意圖,8,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,9,二、基因芯片技術概論,（一）基因芯片的概念 通過微陣列技術將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等載體上，然后與待測的有熒光標記的樣品核酸按堿基配對的原理進行雜交，通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測雜交信號強度。經計算機分析處理數(shù)據(jù)資料，獲取樣品數(shù)量和序列信息，從而可對核酸序列進行大規(guī)模、高通量的研究技術。,10,基因芯片原型,11,12,（二）基因芯片的工作原理 基因芯片的工作原理是根據(jù)堿基互補配對的原理，標記的待測樣本DNA與芯片上特定位置的探針雜交，通過分析處理芯片的雜交檢測圖像確定靶DNA序列，這樣就可對細胞和組織中大量的基因信息進行分析。,13,14,15,三、基因芯片制備技術,（一）原位合成的芯片 基于組合化學的合成原理，它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯(lián)位點和次序。 在片合成法制備DNA芯片的關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和固相合成化學技術的精巧結合。,16,原位合成方法的工作原理,17,Affymetrix公司研究組首次報道和采用合成高密度基因芯片,18,（二）直接點樣法 首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點,并通過物理和化學的結合使探針被固定于芯片的相應位點。,19,1. 探針的準備 根據(jù)實驗的目的，選擇相應的探針及種類，基因芯片的探針主要有寡核苷酸或cDNA。 對于寡核苷酸探針，探針的設計是很關鍵的一個環(huán)節(jié)，需要根據(jù)研究目的設計相應的探針序列，如SNP分析芯片，必須考慮待檢測位點的序列和位置，需要嚴格控制探針的Tm值。如果用于表達譜的研究，目的基因的寡核苷酸探針設計原則是盡量使探針與其他基因之間沒有同源性，即探針的特異性要好。,20,對于cDNA芯片，需要預先克隆到大量目的基因的cDNA克隆，并經過測序驗證。用PCR進行探針的擴增，經過純化后，即可用于點樣。,21,2玻片的表面修飾 對于DNA芯片，點樣法所用載體多為玻璃片 在點樣前，一般先對載體表面進行化學修飾(如多聚賴氨酸或硅烷偶聯(lián)劑等)，使其表面富含氨基并帶正電。修飾后的固相載體表面可利用靜電吸附帶負電的DNA探針，或通過雙功能偶聯(lián)試劑(如戊二醛)輔助形成共價化學鍵而連接。,22,3點樣 (1)點樣系統(tǒng)：點樣系統(tǒng)又叫點樣儀或機械手。在直接點樣法中，采用的機械手有一套計算機控制的三維移動裝置，包括裝點樣針的點樣頭、機械手臂、點樣針清洗系統(tǒng)、芯片載片臺及計算機控制系統(tǒng)。,23,24,點樣方式包括接觸式點樣(針點)和非接觸式點樣(噴點)。 針點是指用針通過直接接觸介質表面將DNA樣品點到介質上。 噴點是通過非接觸式方式將DNA樣品點到介質表面，通常是用加壓的方法傳遞探針 。,25,針點法,26,噴點法,27,2)點樣與點樣后處理： 通常情況下，點樣后處理包括水合、紫外交聯(lián)、洗脫和封閉4個步驟。 水合的目的是保證樣品與基片表面在溶液狀態(tài)下充分反應。 紫外交聯(lián)的目的則是讓樣品與基片表面形成的化學鍵能夠吸收紫外線而變得更加牢固。,28,洗脫的目的是為了洗掉那些沒有牢固結合的樣品，以消除其在雜交過程中的影響。 封閉則是為了消除基片表面活性基團與雜交液中的探針分子之間的非專一性相互作用而產生背景。,29,四、基因芯片的檢測方法,（一）實驗設計1.確定研究目標RNA檢測：基因表達水平的研究DNA檢測：SNP或突變分析、基因拷貝數(shù)研 究及DNA甲基化研究,30,2. 樣本選擇和設計(1)待測樣本的選擇：可以是組織來源的或血液來源的，也可以是培養(yǎng)的細胞或病人的體外分泌物等。(2)對照樣本的選擇：組織表達譜芯片一般選用正常的相同組織與病例組織作為對照。,31,基因芯片技術流程,32,（二）檢測原理1. 用于RNA水平的大規(guī)?；虮磉_譜的研究 由于基因芯片在固定介質和標記染料方面的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)同一張芯片上多種熒光標記。利用雙色熒光系統(tǒng)，可以在一張芯片上實現(xiàn)待測樣本和對照樣本靶序列的同時檢測。,33,基因芯片對基因表達譜的分析,34,2. 檢測DNA的結構及組成 基因芯片可以從不同的方面對DNA進行檢測，如DNA的測序和再測序、DNA的甲基化檢測、基于芯片的比較基因組雜合(CGH)技術等,35,第二節(jié) 基因芯片在心血管疾病基因組 學研究中的應用,一、基因芯片技術與心血管疾病致病基因或遺傳易感性研究(一) 遺傳標記（genetic marker ） 是指可遺傳的并可檢測的DNA序列,36,第一代遺傳標記：限制性片段長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位點變異的突變如點突變（新產生和去除酶切位點）和 一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導致RFLP的產生。,37,限制性片段長度多態(tài)性,38,第二代遺傳標記：微衛(wèi)星標記（microsatellite，MS) 又稱為短串聯(lián)重復序列(simple tandem repeats，STRs)或簡單重復序列（simple sequence repeats） 是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由26個核苷酸的串聯(lián)重復片段構成，由于重復單位的重復次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標記的應用非常廣泛。,39,微衛(wèi)星標記,40,第三代遺傳標志：單核苷酸多態(tài)性標（single nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。,41,42,1.ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCATCTCTATGGG.2.ATCCTGTTCCTACGTGTACAATAGTA. CTGATCATCTCTATGGG.3.ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCAGCTCTATGGG.,1,2,3,SNP1,SNP2,單核苷酸多態(tài)性（SNPs）,42,SNP作為遺傳標記的優(yōu)勢（1）SNP數(shù)量多，分布廣泛，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs 。（2）SNP適于快速、規(guī)?；Y查。 SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標記。 （3）SNP直接影響或決定疾病的發(fā)生。 研究SNP可以預測個人患病可能性，以及疾病預后、對藥物作用的有效性,43,（二）HaplotypeMap（ HapMap）計劃 單體型是指相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP等位位點的集合。,44,2002年10月28日，HapMap計劃正式啟動。這一項目旨在構建整個人類基因組DNA序列中多態(tài)位點的常見模式，至少對100萬個SNP進行全基因組規(guī)模的基因分型。,45,HapMap的構建分為三個步驟：（a）在多個個體的DNA樣品中鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）；（b）將群體中頻率大于1%的那些共同遺傳的相鄰SNPs組合成單體型；（c）在單體型中找出用于識別這些單體型的標簽SNPs。通過對標簽SNPs進行基因分型，研究者可以確定每個個體擁有的單體型。,46,47,（三）致病基因的遺傳易感性研究,1. 群體關聯(lián)分析,48,2. 家系連鎖分析,49,（四）基因芯片技術是遺傳分析的主要手段2007年Samani 等應用Affymetrix 500K SNP芯片, 對德國人心肌梗死家庭研究(GerMI)中875例心肌梗死病例和1644名對照進行基因型檢測,發(fā)現(xiàn)了除9p21區(qū)域的位點rs1333049外的6個與冠心病顯著關聯(lián)的位點。,50,aley等利用含8600個DNA/EST的微陣列，對腫瘤壞死因子刺激的人主動脈血管平滑肌細胞及粥樣硬化的主動脈進行了檢測。發(fā)現(xiàn)新的化學因子eotaxin及其受體CCR3的表達與動脈粥樣硬化的關系極其密切 。,51,二、基因芯片技術與心血管疾病轉錄組學研究 對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導、不同治療階段）下的細胞內的mRNA或逆轉錄后產生的cDNA與表達譜基因芯片進行雜交，可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷，迅速將某個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來，極大地加快這些基因功能的確立，同時進一步研究基因與基因間相互作用的關系。,52,53,總體的研究思路:利用表達譜芯片技術鑒定出參與疾病發(fā)展過程中的關鍵的基因表達，然后通過基因功能的各種研究方法如基因敲除、中和抗體等技術來證明關鍵基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中的功能。,54,Rysa等 以含4 000個CDNA/表達序列標簽(EST)微陣列檢測自發(fā)性高血壓引起的進行性左心室肥大小鼠心室基因表達，證實了進行性左心室肥大與收縮蛋白和利鈉肽基因的表達增高有關。并對20個月和12個月的自發(fā)性高血壓小鼠心室基因表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)了有92個已知基因和35個EST表達有差異，其中的上調基因主要編碼細胞結構和信號蛋白，大多數(shù)的下調基因則編碼與脂肪酸和能量代謝相關的蛋白質。,55,Litvin等通過下腔靜脈造瘺造成小鼠因體積負荷而導致心肌肥大，用Afymetrix基因表達芯片檢測心肌中PLF基因家族的表達水平，發(fā)現(xiàn)在心肌肥大的過程中其表達水平升高，而通過手術降低負荷后其表達水平則下降，表明心肌肥大的發(fā)展與PLF基因家族的表達水平有關，從而為心肌肥大的基因治療提供了可能。,56,三、基因芯片技術與心血管疾病藥物基因組學研究,（一）藥理研究中的應用 推測藥物作用機制及靶點（二）毒理研究中的應用,57,四、基因芯片技術與心血管疾病個性化用藥研究,（一）高血壓的藥物個性化治療1.AGT基因多態(tài)性與降壓療效：用血管緊張素轉換酶抑制(ACEI)卡托普利、依那普利、賴諾普利和培垛普利研究的抗高血壓藥物療效，發(fā)現(xiàn)T/T、T/M基因型患者治療后的血壓下降比M/M基因型患者顯著。2.ACE基因多態(tài)性與降壓療效: 福辛普利降低收縮壓及舒張壓的作用，在D/D基因型高血壓患者較I/I型、I/D型患者更明顯 。,58,3. ATR基因多態(tài)性與降壓療效：AT1 R基因多態(tài)性(A1166C)與ACEI類藥物的降壓療效相關，且此相關性在老年患者和超體重患者中尤為明顯。4.利尿藥的療效: ACE和-adducin的基因多態(tài)性對利尿藥的降壓效果有影響；同時攜帶ACE的I型等位基因及-adducin的Trp460等位基因的患者，氫氯噻嗪的療效最好。而攜帶ACE的D/D等位基因及-adducin的Gly/Trp等位基因的患者，治療后血壓下降最少。所以聯(lián)合分析ACE和-adducin的兩個基因多態(tài)性有助于預測利尿劑的療效。,59,(二)脂質代