1 2胞誘導率影響的設計書 第一部分 文獻綜述 1 胞發(fā)展簡介 1.1 胞的誘導 胞的誕生 成熟的體細胞由分化的狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)的過程稱之為細胞重編程，細胞重編程現(xiàn)象最早在核移植實驗中被發(fā)現(xiàn)。細胞重編程的方法包括體細胞核移植、 擾細胞質(zhì)重編程技術(shù)、多能干細胞和體細胞融合、多能細胞的提取物與體細胞共孵育等。其重編程過程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、 基化、組蛋白乙?；?、印記基因表達、端粒長度恢復以及 x 染色體失活等。重編程后，體細胞核 會忘卻原先體細胞留下的記憶重新進人發(fā)育程序。 都通過自己的實驗誘導體細胞重編程成功。但是這些方法最大的缺點就是供卵缺乏、倫理道德及政府法規(guī)的限制等。因此科學家們努力尋求從法律、道德和倫理等方面更易被人們接受的體細胞核重編程的方法。 細胞核移植和干細胞這兩個各自迷人的領(lǐng)域，在 2006 年發(fā)生了非常引人注目的碰撞。一些重大的發(fā)現(xiàn)為這次事件鋪平了道路。正如兩棲動物中一樣，細胞核移植進入小鼠卵母細胞后表明體細胞核重編程成為多能肽。 2006 年 8 月，通過對卵母細胞和胚胎干細胞中涉及細胞重編 程的細胞因子的深入分析和研究，日本科學家 究小組將 24 種轉(zhuǎn)錄因子排列組合導入小鼠成纖維細胞，最終確定有 4 種轉(zhuǎn)錄因子組合 可將成纖維細胞重編程為誘導多能性干細胞(胞。它的誕生仿佛給沉寂一時的國際干細 2 胞研究打入了一劑強心劑 1。 入 胞的外源轉(zhuǎn)錄因子 通過外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的誘導，使成體細胞重編程為胚胎干細胞 (胞 ) 樣 的多能細胞，這種細胞稱為誘導多能干細胞 (胞 )，這一方法被稱為 術(shù)。 胞除了不能生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細胞，如果用于醫(yī)療，那么理論上可以治愈所有疾病 凡是不好的組織都去除，替換為重新生長的正常組織。它的功能幾乎可以和 胞 相媲美。 自從 胞涉及道德倫理的問題以來 ，科學家用其來產(chǎn)生新生組織的想法就一直不能實施。而 其突破倫理障礙的面貌改變大家對干細胞的看法，無疑， 偉大的發(fā)現(xiàn)，它讓科學家們可以更深入地了解我們的細胞。也讓干細胞從理論研究到臨床應用的步伐加快了許 多，直接將病人的成體細胞改造成干細胞， 比再培育一個小孩取干細胞更符合倫理道德要求，也突破了移植排斥的障礙。 胞和 胞具有相同的基因。不同的是 胞中與細胞多能性有關(guān)的基因能夠表達，而這些因子就是 分化的細胞中這些基因不能表達。通過導入與多能性有關(guān)的外源基因來激活活體細胞中的多能性基因。從而使體細胞從分化狀態(tài)重編程為多能干細胞。 試驗中所用 4 種轉(zhuǎn)錄因子在誘導過程中分別起不同作用： 族的轉(zhuǎn)錄因子 ,維持細胞的多能性 ,是體細胞誘導為 胞所必須的基因。在小鼠和人的 胞中 , 達的抑制將會導致自發(fā)性分化為滋養(yǎng)層細胞。 實驗結(jié)果表明 ,夠維持 胞未分化狀態(tài)并促進其增殖 ,并認為 活化是重編程為多能干細胞的標志。 胚胎干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 ,其與 樣均為體細胞重編程所必須的基因 ,除了可與 同調(diào)節(jié)維持細胞的多能性之外 ,還能促進干細胞向神經(jīng)外胚層分化。 是 胞形成所必須的基因 ,其作用是提高克隆形成的效率 ,當同時將二者去除時 胞將不 能生成 胞 ,因此 胞產(chǎn)生的過程中同樣重要。 在人類癌細胞中發(fā)現(xiàn)的卟啉 盡管 以提高 胞克隆形成率 ,但其構(gòu)建的嵌合體小鼠約 20%發(fā) 3 生了腫瘤。所以如果將 胞用于臨床治療 , 因的轉(zhuǎn)入必須慎重。是抑癌基因又是原癌基因 ,一方面可以促進 胞的自我更新 ,另一方面在體細胞中強制表達可抑制 阻滯細胞周期于 期 ,因此它在細胞增殖和分化之間起開關(guān)作用 2。 體細胞的選擇 術(shù)雖然在不同物種的多種細胞上 都取得了成功，但是不同的受體細胞、不同的細胞狀態(tài)及其傳代代數(shù)，對于誘導的效率，甚至誘導是否能取得成功都有一定的影響。因此，在實驗之初需準備符合要求的受體細胞。最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纖維細胞為受體細胞進行 導，雖然最終都得到了 胞，但是采用胎兒細胞進行的誘導效率明顯要高一些。這可能是由于胎兒細胞增殖活力強，并且甲基化程度較低，易于重編程。隨后，以小鼠肝臟細胞、胃表皮細胞、胰腺細胞，甚至成熟的 B 淋巴細胞作為受體細胞進行 導也都取得了成功，這充分說明了 術(shù)的普遍適用性，也 證明了各類體細胞都具有被重編程為多能性細胞的潛能。研究發(fā)現(xiàn)不同類型細胞來源的 胞具有不同的特點，如肝臟細胞和胃上皮細胞來源的 胞其基因組不易被病毒整合，具有較低的致瘤性，更適合于醫(yī)學研究的需要。 也發(fā)現(xiàn)以角質(zhì)細胞作為受體細胞可顯著提高 誘導效率，并能降低病毒在受體細胞基因組上的整合。另外，神經(jīng)干細胞本身表達較高的內(nèi)源性 因子，當采用 個因子時，也能產(chǎn)生較高效率的 胞。因此，神經(jīng)干細胞可以作為理想的受體細胞。不同受體細胞對于誘導效率的差異至今仍沒 有確切的解釋，但是從 導的過程可以認為，這可能是由于不同受體細胞間的表觀遺傳修飾的差異引起的。不同細胞基因組的甲基化和乙?；潭雀鞑幌嗤?，誘導重編程過程中開啟外源基因表達的要求也不一樣，如誘導過程中添加甲基化酶抑制劑可以明顯提高誘導的效率。同時，有的受體細胞自身也表達部分的誘導因子，這不僅可以減少外源基因的使用數(shù)量，同時也減輕了重編程的負擔，進而可以得到較高的 導效率，且減少誘導的時間，例如神經(jīng)干細胞誘導為 胞。由于取材和培養(yǎng)簡便，原代成纖維細胞仍然是導中最常用的受體細胞。 同時，為了確保受體細胞的增殖活力，盡可能使用低代數(shù) (35 代 ) 的原代細胞進行誘導 3。 4 1.2 胞的表觀遺傳學 誘導得到的 胞以相應物種的 胞為參照標準，從分子、細胞和動物個體水平對其進行系統(tǒng)的檢測。包括其多能性細胞特異的標志基因的表達情況，向 3 個胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及 確的遺傳背景。 子水平上 胞中導入的外源基因表達水平要隨著重編程的完成逐漸降低或沉默，內(nèi)源的多能性基因表達激活，基因的選擇以 胞表達的特 異性標志為參照。如通過 測 基因的表達情況且此類基因在不同物種間的表達不完全相同，如小鼠的 般 陽性， 陰性。而人的 胞則正好與之相反， 陰性， 陽性。此外，為了明確 胞的永生化能力，還需檢測其端粒酶活性。 胞水平 多向分化潛能和體外自我更新的能力。所得到的 胞首先形態(tài)上要與 胞相類似，具體表現(xiàn)為細胞呈集落樣生長、集落致密且邊緣整齊、細胞形態(tài)較小、核質(zhì)比高、增殖迅速、倍增時間短、能夠長期傳代。 胞經(jīng) 色鑒定，要求呈陽性，還需進行多種轉(zhuǎn)錄因子及細胞表面標志的免疫熒光染色及流式細胞技術(shù)的分選，如： 。完全重編程的 胞應具有體外分化潛能，能夠分化為各個胚層的不同類型的細胞，如外胚層的神經(jīng)細胞、上皮細胞、軟骨細胞等；中胚層的肌肉細胞、脂肪細胞等；內(nèi)胚層的肝細胞、胰島細胞等。此外，還需檢測 胞 的核型情況，由于外源基因整合的隨機性，使誘導得到的 胞會有較高比例的核型異常，那些核型異常的 胞，應予以剔除。 物水平 對 胞在免疫缺陷鼠 (如 鼠 ) 體內(nèi)進行成瘤實驗。將1 1065 106 胞注射到裸鼠的皮下，經(jīng)過一段時間的生長，來觀察皮下畸胎瘤形成的變化。根據(jù)動物來源的不同， 胞成瘤時間也不盡相同，如小鼠的 胞約在 1 個月左右能成瘤，但是豬的 胞需要 13 個月 5 時間才能成瘤。取出的瘤組織，經(jīng)切片檢測其是否發(fā)育 出 3 個胚層的各種組織。同時，在條件及倫理道德允許的情況下，還應將 胞在相應物種上進行嵌合體實驗，要求后代能夠真正生殖系嵌合。但與 胞類似，由于倫理道德等問題的限制，這一指標至今仍只在小鼠上獲得成功。最近有研究報道，小鼠 胞通過與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由胞發(fā)育而來的小鼠，這充分說明了 胞具有發(fā)育為完整個體的能力。 1.3 胞的發(fā)展及應用 成功建立 胞后，應用 胞來治療疾病是人們的最終目標。 ，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法。 胞的分化和移植在治療血液疾病中的作用 胞誘導分化為內(nèi)皮前體細胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝臟中，使病鼠出血不止的癥狀得到了有效地改善。 患病小鼠尾尖成纖維細胞重編程為 胞，然后通過同源重組的方法用人野生型蛋白基因替代了 蛋白基因，接著把遺傳修飾后的 胞定向分化為造血祖細胞 (并將純化后的 植入 性小鼠中，效地抑制了鐮刀形紅細胞貧血癥癥狀。 獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性 胞，這些 胞能夠分化形成表型正常的髓系和紅系的造血祖細胞。中內(nèi)啟光等研究人員在培養(yǎng) 胞時，添加人類骨髓細胞以及促進細胞增殖的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，結(jié)果 胞分化成了血小板的前身巨核細胞，巨核細胞進一步分化成血小板。從技術(shù)上來說，用 胞培育人類紅細胞和白細胞都是可能的。紅細胞體外培育的成功為人類研究通用紅細胞提供了新的契機。研究組正在努力用一種 0 型 性個體體細胞重編程為 胞，進而對該 胞進 行體外定向誘導分化，培育出通用紅細胞。 建立了一個從人 胞高效地分化成紅細胞的系統(tǒng)。如果將該系統(tǒng)應用于患者特異性 胞上，就可獲得無限量的患者自身的紅細胞，這對于治療一些血液疾病以及為罕見血型患者提供血細胞有著重要意義。 胞還可治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病 6 將 胞分化為神經(jīng)前體細胞，然后把這些細胞移植入胎鼠腦中，它們可整合到受體鼠的腦中， 13 5 d 后形成神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞，包括谷氨酰胺能神經(jīng)元、 神經(jīng)元、兒茶酚胺能神經(jīng)元細胞。將由小鼠 胞在 體外誘導分化來的多巴胺能神經(jīng)元移植進帕金森病大鼠模型腦內(nèi)，一段時間后可有效緩解大鼠疾病癥狀和改善其行為。最近，利用帕金森癥患者的皮膚細胞培育出 胞后，又成功將其分化為多巴胺神經(jīng)元細胞，這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細胞口。因此，其有望成為治療帕金森癥的一種方法。 胞也有望應用于治療不孕癥 將人 胞體外分化并分離得到原始生殖細胞 ( 基因表達上與體內(nèi)分離的 為相似。如果能夠進一步將這些 化為精子和卵子，就可幫助患者解決不孕問題。 供體外的疾病模型 提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法。 和 分別建立了肌萎縮側(cè)索硬化癥 (脊髓性肌萎縮 (者特異性 胞。通過定向誘導分化，將患者特異性的 胞成功分化成了運動神經(jīng)元。這些由患者來源的 胞分化等的運動神經(jīng)元為人們提供了一個體外研究 病的系統(tǒng)。在研究清楚了 者運動神經(jīng)元的致病機制后，還可在患者特異的 胞中通過遺傳修飾來糾正基因缺陷，再分化得到功能正常 的運動神經(jīng)元，以進行移植治療。此外， 和 建立了多種遺傳病患者特異性的 胞系，包括帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征三染色體 21 等。 成功地以人血液細胞為體細胞供體，誘導出了 胞，使得構(gòu)建一些病癥突變只局限于血液細胞的患者特異性 胞成為可能。利用從罕見神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者身上產(chǎn)生的干細胞，科學家們正在解析該種疾病的發(fā)病機制，并以此來測試若干候選藥物的療效。從家族性植物神經(jīng)功能不全癥 (有一個基因突變，該基因?qū)Φ鞍走M行編碼，基因突變導致基因被轉(zhuǎn)譯成蛋 白時部分基因序列被跳過 )患者身上獲取皮膚細胞，創(chuàng)建出 胞系，誘導為特定的細胞類型，如神經(jīng)嵴細胞 (它能產(chǎn)生受 響的神經(jīng)元 )。 7 這些細胞在分化成神經(jīng)元的能力上是具有缺陷的，其并不像培養(yǎng)皿中的正常細胞一樣容易遷移。研究人員利用此種差異來衡量 3 種藥物的療效，這幾種藥已被提議作為治療 候選藥物，其中一種藥物就是激動素。這些患者特異性 胞令體外研究病變的人體組織的形成成為可能，從而有助于探索疾病形成機制以及研發(fā)特異性新藥。這些研究成果還表明將來有可能為患者量身定做各種細胞，進行個性化治療。但是由 于對于細胞 (包括 胞、 胞和成體干細胞 )自我更新與分化等行為的調(diào)控機制知之甚少，目前人們還不能按照自己的意圖將干細胞在體外定向誘導分化為所需要的任何的功能細胞。隨著人類對干細胞分化調(diào)控機制認識的不斷加深，從人 胞將會衍生出更多種類的人類細胞，將為細胞替代治療新藥篩選與評價及其他用途提供大量的細胞。 術(shù)方面的障礙 經(jīng)過了近 4 年既漫長又短暫的發(fā)展 , 胞技術(shù)已經(jīng)取得了舉世矚目的進展。一個個突破性的成果既給我們帶來了喜悅 , 也帶來了新的挑戰(zhàn) , 細胞重編程有望迎來一個新的研究 浪潮。盡管在 胞方面取得了如此大的成就，但是 胞的成功誘導比較復雜，誘導率比較低，科學家不依靠所謂的“基因搭載”也可以產(chǎn)生 胞， 4 種關(guān)鍵因子現(xiàn)在已作為蛋白質(zhì)注射被應用。然而這種方法的效果還是很低，平均 1 萬個普通細胞只有 1 個能變成 胞，少數(shù)獲得的 胞還必須從細胞混合物中進行分離，整個過程至少需要 3 周至 4 周。因此誘導效率一直是科學界的難題，要想將 胞進行大規(guī)模生產(chǎn)就必須首先解決其誘導率問題。 來自不同國家的 5 個科研小組同時報告了相關(guān)進展，其中包括最先培育出胞的日本科學家山中伸彌的科研小組?？茖W家發(fā)現(xiàn)，通過阻斷一個名為“ 的基因的路徑，可以將皮膚細胞轉(zhuǎn)化為 胞的成功率提高至 10左右，是原有轉(zhuǎn)化率的大約百倍 。從而看出只要用合適的方法阻斷 因（ 位于 17 號染色體短臂上 (長 16 20 11 個外顯子組成，編碼著393 個氨基酸組成的核磷酸蛋白，因其分子量為 53得名 。）的表達，就可大大提高 胞的轉(zhuǎn)化 . 這樣有針對性地使一定的 段開啟或關(guān)閉是一個重要機制，可以控制體細胞不同的功能，并使每個細胞適用 序的 8 變化。但是 有抑制細胞癌變、阻止腫瘤生長的作用，因此在通過阻斷“ 路徑提高 胞轉(zhuǎn)化率時， 腫瘤發(fā)生幾率就會大大增加，因而，采用這種方法存在著很大的風險。而且阻斷 因路徑的方法復雜。 為了避免病毒和外源基因?qū)Φ玫降?胞產(chǎn)生的影響，研究者直接采用以上 4 個轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)對受體細胞進行誘導。但是由于蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)不 穩(wěn)定，不能持續(xù)作用，因此需要對受體細胞進行多次的蛋白處理。 采用隔天多次將受體細胞與外源蛋白進行共培養(yǎng)的方法，通過特定的信號轉(zhuǎn)導肽將其運送至受體細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，通過 4 輪蛋白因子的處理，再結(jié)合 輔助，才最終成功誘導得到 隆。而 則采用穩(wěn)定表達四因子融合蛋白的 胞的裂解產(chǎn)物誘導人成纖維細胞，可最初連續(xù) 6 d 的誘導處理卻引起受體細胞的死亡；隨后通過 16 h 的蛋白誘導處理與新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 6 d 相結(jié)合，進行反復 6 輪誘導之后才最終得到了 隆。蛋白質(zhì)分子誘導 胞的效率極低，且所需時間很長。因此，這種方法可行性很低 3。 體細胞胞與 胞相比處于更高的甲基化狀態(tài)。我們可以通過在轉(zhuǎn)化過程中抑制體細胞的甲基化來提高的 胞的誘導效率。通過查閱文獻了解到小分子化合物 2 5以抑制基因組的甲基化狀態(tài)，提高其誘導率，且它們來源廣泛、操作簡單，為我們研究提高 胞誘導率提供充分的理論依據(jù)。 2、促進 胞誘導率的 小分子化合物 中文別名 :2,2正丙基乙酸 ,二丙基乙酸 , 4分子式： 子量 狀： 無色液體 、 極微溶于水 、 相對密度 (沸點 221 、128 130 ( 折光率 (低毒，半數(shù)致死量 (大鼠，經(jīng)口 )670mg/有腐蝕性。 其分子式如圖 1 所示。 圖 1 9 白色針狀結(jié)晶，溶于水，在酸和堿中易水解 。其分子式如圖 2 為 圖 2 51210、 鼠淋巴細胞白血病和 均有明顯抗腫瘤作用，是主要作用于 S 期周期特異性藥。其抗腫 瘤作用與其他嘧啶類拮抗劑不同，與嘧啶核苷酸代謝并無關(guān)系，而是以偽代謝物身份替代胞嘧啶 摻入 擾 生理功能而產(chǎn)生細胞毒作用及抗腫瘤作用。近年來更注意到氮雜胞苷可 摻入 基化過程。許多基因的轉(zhuǎn)錄功能與嘧啶以甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，在整個細胞分裂過程中，通過甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，這種甲基化作用始終保持無缺，氮雜胞苷由于可 摻入 制 基化，因此影響基因的表達及分化 4。但是氮雜胞苷并不是影響所有基因的表達，而是對某些基因的表達有影響，對另外一些基因的表達則無影響 。 3 總結(jié) 本設計研究的價值 隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的的不斷提高，人們對健康的重視程度越來越深入然而，面對許多疾病，科學家們也束手無策。這時 胞的出現(xiàn)讓全世界人民臉上都露出了燦爛的笑容。 胞研究成果在干細胞和發(fā)育生物學研究領(lǐng)域中無疑具有里程碑意義，其在短時間內(nèi)取得了一系列突破，可以預見，有朝一日， 胞必將應用于臨床，解決人類面臨的各種疾患等，獲得安全、高效、實用、有臨床應用價值的治療型 胞。 胞的研究使我們無需毀滅胚胎就可以得到類 0 細胞，這樣就回避了長期以來人們對人類胚胎使用 問題的倫理問題，為干細胞的研究、新藥篩選及藥物毒理研究和再生醫(yī)學領(lǐng)域提供了新方法和新技術(shù)，并是以后獲得患者自身遺傳背景的胚胎干細胞的重要途徑之一，也是研究人類疾病機理的重要方法之一，對將來的醫(yī)學研究有著巨大的理論意義和實用價值。胞可能成為人類各種疾病細胞移植的一個資源，為人類疾病治療帶來了新的希望和契機，其研究的最終目的是應用于臨床進行自體細胞治療，現(xiàn)在很多人都非常期待 胞能盡早應用于多種疾病的臨床治療，如 1 型糖尿病、帕金森綜合征、脊髓損傷及慢性肝病等。 目前， 胞的應用取得了令人矚目的 進展。但是， 胞的誘導率很低，怎樣提高 胞的誘導率是許多研究人員共同面臨的問題。只有進一步闡明 胞產(chǎn)生的機制，成功地誘導出疾病特異性 胞，改善 胞的質(zhì)量，提高誘導率，降低致瘤性，才能有助于推動 胞的臨床應用向前發(fā)展。 本課程設計從 胞比 胞甲基化程度高著手，研究提高 胞誘導率的方法。通過從作用機制、藥品來源、操作難易程度以及誘導后有無副作用幾方面進行分析，選取了 2 5前暫無人使用此法研究 胞 誘導，希望本設計能 胞的高效率誘導提供一條可行性途徑。 11 第二部分 課程設計部分 2 5胞誘導率的影響 胞的問世，將干細胞研究推進到了一個新的高度，極大豐富了干細胞的研究內(nèi)容。它由體細胞導入外源轉(zhuǎn)錄因子重編程誘導而來，與 胞在功能、形態(tài)上基本一致。它除了生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細胞，如果用于醫(yī)療，理論上可以治愈所有疾病 凡是不好的組織都去除，替換為重新生長的正常組織。它避免了 胞所遇到的免疫排斥和倫理道德問題，因此可作為胚胎干細胞最好 的替代品用于科學研究和臨床治療，由于多潛能性干細胞的多向分化潛能和自我更新的特性 , 使其在細胞替代治療、基因治療、發(fā)育生物學研究、藥理及毒理學等領(lǐng)域的研究中有著其獨特的作用和優(yōu)越性，使干細胞研究向前邁進了一大步 5。近幾年， 胞像初升的太陽一樣正在冉冉升起，在 胞方面研究的成果不斷被公布出來包括體外疾病模型建立、藥物篩選、細胞替代治療等。在 胞的應用取得了令人矚目的成就時，橫跨在科學界的一大障礙卻始終沒有被排除，它就是 胞的誘導率問題。每萬個細胞中只有一個可以被成功誘導，這給 胞的大規(guī)模生產(chǎn)帶來了阻礙。體細胞比 胞處于更高的甲基化狀態(tài)，在 胞有誘導的過程中加入小分子化合物 2 5接提高受體細胞被誘導的效率 3。目前 ,關(guān)于 胞誘導率研究的報道還很少。本設計把這兩種物質(zhì)聯(lián)合來進行 胞誘導，尚屬首例，填補了無人著重研究使用小分子化合物進行 胞誘導的空白。本實驗設計在進行 胞誘導的培養(yǎng) 12 基中分別加入不同劑量的小分子化合物 2 5期通過實驗得到 2 5胞苷以及二者的混合物對 胞誘導的影響，以尋求提高 胞誘導率的最佳途徑。 1 材料 鼠 攜帶有 基因的小鼠，購自南京大學。不帶轉(zhuǎn)基因的小白鼠由本實驗室提供。 胞株、質(zhì)粒 細胞株、質(zhì)粒 廠商 美國 國 國 國 c 國 E 細胞、 上海生命 科學研究院 試劑 廠商 染試劑 司 培養(yǎng)液 司 胰酶 司 非必需氨基酸 司 青霉素 /鏈霉素 司 司 司 司 胎牛血清 司 白血病抑制因子 司 上海源葉生物科技有限公司 堿性磷酸酶（ 上海如吉生物科技發(fā)展有限公 司 2國藥集團化學試劑有限公司 5拓新集團 要器材 13 儀器 廠商 型號 高速臺式低溫離心機 德國 濕度 胞培養(yǎng)箱 美國 熒光顯微鏡 日本 600 6 孔板 北京耀北生物技術(shù)公司 自動數(shù)字天平 自動高壓消毒鍋 日本 方法 胞培養(yǎng)基的制備 養(yǎng)基的制備 按照 88%培養(yǎng)液， 10%胎牛血清， 1 %青霉素 /鏈霉素， 1%非必需氨基酸的量進行 混合，用 m 濾膜過濾后于 4 保存。 胞培養(yǎng)基的制備 按照 80%培養(yǎng)液， 15%胎牛血清， 1 % 1%非必需氨基酸， 1 % 1 %青霉素 /鏈霉素， 1% 1 000 血病抑制因子 的量進行混合，用 m 濾膜過濾后于 4 保存。 養(yǎng)層細胞的制備 制備 處死妊娠 13.5 d 的攜帶有 基因的母鼠，用無菌手術(shù)器械剖腹取出胚胎，用 洗。去除胚胎的頭部、尾部、內(nèi)臟及四肢。軀干部分用 洗干凈。將組織塊剪碎，移入 50 心管中，加入 胰酶于 37 消化 20 到出現(xiàn)大量單細胞，加入 養(yǎng)基終止，吹打后制成細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)入 100 養(yǎng)皿中，補加適量 養(yǎng)基。來回晃動培養(yǎng)皿后，置于 37 細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞長滿時將其凍存。 養(yǎng)層細胞的制備 養(yǎng)層細胞的制備處理方法大致同 是所用的小白鼠并非為轉(zhuǎn)基因鼠。 射線照射滅活后作為飼養(yǎng)層細 胞使用。 導產(chǎn)生 胞 14 將質(zhì)粒 ( c 分別通過 染試劑 轉(zhuǎn)染 E 細胞，次日換液，并于 48 h 后收取逆轉(zhuǎn)錄病毒液，經(jīng) m 濾膜過濾后待用，對應的 5 種病毒液分別記為 G， O， S， K， M。 O， S， K， M 以 1 1 1 1 比例感染 感染后第 4 天，將細胞用胰酶消化，計數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有養(yǎng)層細胞的 6 孔板，密度為每孔 5 104 個細胞 。 至飼養(yǎng)層細胞上之后每天更換 養(yǎng)基。分別在感染后第 12 天和第 16 天對 胞誘導效率檢測。 2.4 胞誘導率的測定 染病毒后第 12 天， 6 孔板用于堿性磷酸酶染色( 色 )， 性克隆比率越高， 性細胞比例越高，則表示胞誘導效率越高。據(jù) 色結(jié)果，將 性克隆的個數(shù)除以原始接種的 胞數(shù)目，可以得到的 性克隆比率即為 胞系的鑒定 從誘導產(chǎn)生的 隆中選取 性克隆進行擴大培養(yǎng)，建立起 胞系，并對 胞系進行鑒定。鑒定主要包括如下兩個方面 : (1)用熒光顯微鏡檢測 胞系的 達情況 ; ( 2) 用堿性磷酸酶染色檢測 胞系是否處于未分化狀態(tài)。 色熒光蛋白表達檢測 用熒光顯微鏡對所建立的 胞系進行 達檢測。誘導后的 明它可以長期保持未分化狀態(tài)。此外，這些 胞呈克隆狀生長，克隆內(nèi)部 細胞均質(zhì)，單個細胞核質(zhì)比高，克隆形態(tài)和胚胎干細胞相似。 性磷酸酶染色鑒定 堿性磷酸酶染色鑒定小鼠 胞和 胞都表達堿性磷酸酶 ( 的活性，除牛的 胞不表達 活性外，其它動物和人的 胞都表達 15 活性，分化的 胞不表達，所以 活性可作為鑒定 胞是否分化的一個標志。本文采用 色法對 胞系 1 進行鑒定，結(jié)果顯示幾乎整個 落都呈現(xiàn)很強的堿性磷酸酶活性，具備 胞的多能性特征，證明 1 處 于未分化狀態(tài)。 3 設計 胞苷 對 胞誘導率的影響 將細胞用胰酶消化，計數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別加入 分子化合物5第六個孔不加如小分子化合物，用來做對照。誘導完之后，分別計算出每個孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而得出 5 胞誘導率最高時的劑量，判斷它的影響程度。 胞誘導率的影響 將細胞用胰酶消化，計數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別加入 分子化合物 2第六個孔不加如小分子化合物，用來做對照。誘導完之后，分別計算出每個孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而得出 2 胞誘導率最高時的劑量，判斷它的影響大小。 5 胞苷 共同對 胞誘導率的影響 將細胞用胰酶消化，計數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別以 1:1、 1:2、 2:1、 3:1 小分子化合物 25 胞苷 的混合物，經(jīng)過培 養(yǎng)誘導，分別計算出分別計算出每個孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而顯示出 2 5怎樣比例混合對 胞誘導率的影響最大。 4 分析與總結(jié) 胞誘導率的影響 5摻入 基化過程。許多基因的 16 轉(zhuǎn)錄功能與嘧啶以甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，在整個細胞分裂過程中，通過甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，這種甲基化作用始終保持無缺，氮雜胞苷由于可摻入 制 基化，因此影響基因的表達及分化。而體細胞與 胞的區(qū)別之處正在于，體細胞具有高的甲基化狀態(tài)，而不能表 現(xiàn) 胞的多能分化的特點，能得出 5胞的誘導率。本設計中 5基化的功能，設計不同的劑量對 胞的誘導率的影響， 定出 胞的轉(zhuǎn)化率，并通過堿性磷酸酶染色鑒定 、綠色熒光蛋白表達檢測對 胞系進行純度鑒定。從而判斷出最適的劑量。 胞誘導率的影響 2胞的誘導率，其作用機理可能也是抑制 還不是很明確。本設計通過與 比能得出 25適劑量時，哪種物質(zhì)對 胞的誘導率貢獻更大。 5胞誘導率的影響 25胞的誘導率，把他們摻在一起誘導 胞生成。誘導完成之后， 定出 胞的轉(zhuǎn)化率，并通過堿性磷酸酶染色鑒定 、綠色熒光蛋白表達檢測對 胞系進行純度鑒定，從而判斷出他們能否具有協(xié)同作用。以尋求出誘導小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為 本設計通過 種小分子分別在最適劑量時誘導小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為 胞的誘導率，從而判斷在誘導 胞時，哪種小分子作用更有效。通過 以的得到它們摻在一起誘導的效率。通過這三組實驗的對比，得到 25胞的誘導率高，以及共同作用時對 胞的誘導效率高。從而，為提高 胞的誘導率提供可行性方案。 5 課程設計心得 本次課程設計我的題目定位 2 5胞誘導率的影響。我們進行了三周的課設，這段時間里我們緊張的為 它忙碌著。但是， 17 收獲了很多，很充實。 首先，在設計之初我腦中的初步模型是研究器官、組織再生。通過查閱很多的文獻資料，我對 胞產(chǎn)生了極大地興趣。 胞因其生物學、醫(yī)學等方面廣泛的應用前景在誘導成功后只有四年的時間里，各項成果不斷被推起。從而也證明的它的價值。因此，我決定著手于 胞的研究。通過大量的閱讀關(guān)于 胞的文獻，發(fā)現(xiàn)了一個重要的問題。盡管 胞已經(jīng)取得了許多令人矚目的成就，而且有很廣闊的應用前景。但是，它的誘導率確是科學界的一大障礙。因而，我選擇了對其 胞誘導率的研究。在反 復的查看文獻之后，發(fā)現(xiàn)了 2 5 胞苷 這兩種小分子化合物可以對 胞的成功誘導起促進作用。經(jīng)過與同學們的探討把題目定了下來。 然后，在設計過程中遇到了很多問題，由于 胞研究的時間按短，所以有關(guān)這方面的文獻很少，而關(guān)于其誘導率的文獻更少。但是，通過深入的思考以及與同學們的共同研究，確定了整體設計思路。在書寫論文的過程中出現(xiàn)了很多細微的錯誤，比如：格式、字體等等。經(jīng)過幾遍的再查以及同學復查之后，形成了最后的論文。 最后，在課設的過程中，我學到了很多：將