學(xué)科教育論文-組合化學(xué)的高通量合成策略【摘要】本文對(duì)一門新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)。【關(guān)鍵詞】組合化學(xué)高通量合成新藥開發(fā)20世紀(jì)80年代末興起的組合化學(xué)技術(shù)在新藥開發(fā)的過程中,在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化上取得了卓有成效的研發(fā)結(jié)果。組合化學(xué)所運(yùn)用的高通量合成技術(shù)與傳統(tǒng)的有機(jī)合成有顯著的不同。如圖1所示,一般有機(jī)合成方法每次合成得到一個(gè)產(chǎn)物。高通量合成技術(shù)則是進(jìn)行組合合成,用一個(gè)構(gòu)建模塊A與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),可以得到n個(gè)產(chǎn)物。用一個(gè)構(gòu)建模塊A的m個(gè)單元與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),則得到mn個(gè)化合物；若進(jìn)行Y步反應(yīng),則得到nnY或mnY個(gè)化合物。有人作過統(tǒng)計(jì),一個(gè)化學(xué)家用組合合成在26周完成的工作量,相當(dāng)于十個(gè)化學(xué)家用傳統(tǒng)方法花費(fèi)一年時(shí)間才能合成得到的化合物數(shù)目。由此可見,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時(shí)間和資金的消耗,成為繼20世紀(jì)末至今化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。高通量合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類,組合化合物庫也相應(yīng)的分類為固相庫和液相庫。因此庫化合物的合成策略應(yīng)當(dāng)圍繞著這二大類組合合成展開進(jìn)行。高通量合成從合成方法學(xué)上來說,可歸納為以下三種方式:平行合成法；裂分合成法；集組式合成。1平行合成法(Parallelsynthesis)也稱間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統(tǒng)有機(jī)合成的原理相似,通過空間隔開的整齊排列的反應(yīng)器皿來平行合成化合物。由于在特定區(qū)域可得到很純的化合物,因此化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定容易,參數(shù)相對(duì)容易取得。該方法的特點(diǎn)是合成速度較快、化合物數(shù)目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經(jīng)激肽-2拮抗劑類似物等化合物庫的制備。當(dāng)化合物庫有許多生物活性化合物供篩選時(shí),使用平行合成法最適合。因?yàn)槠叫泻铣煞ê铣傻幕衔锸且豢滓换衔?單個(gè)化合物對(duì)新藥開發(fā)中先導(dǎo)化合物優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究(SAR)特別有價(jià)值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對(duì)應(yīng)大量單個(gè)化合物的液相庫和固相庫。固相庫的合成產(chǎn)量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來說液相庫的產(chǎn)量較固相庫高。化合物庫容量在幾千以上時(shí),多采用自動(dòng)化裝置進(jìn)行合成。1.1多針法(Polypin)也稱多中心合成法,它是Geyson教授發(fā)明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應(yīng)裝置。該裝置每孔對(duì)應(yīng)使用長(zhǎng)40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進(jìn)行操作。每個(gè)小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過25mg的產(chǎn)物。這種多針合成反應(yīng)裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學(xué)研究上。多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用射線照射,使針的表面活化?；罨蟮尼槺霍然采w。這些羧基與長(zhǎng)鏈的結(jié)合分子連接后,就提供了既能增加反應(yīng)體系流動(dòng)性又可以連接構(gòu)件的氨基基團(tuán)。把不同的氨基酸溶液反應(yīng)試劑移到96孔微板的每個(gè)孔中,即可對(duì)每一根針進(jìn)行獨(dú)立的合成反應(yīng)。在每步反應(yīng)完成后將小棒移開,在一個(gè)公共反應(yīng)器中對(duì)這些小棒同時(shí)進(jìn)行樹脂珠的沖洗等純化操作。重復(fù)這些操作直至拿到理想化合物。對(duì)應(yīng)小棒上的目標(biāo)產(chǎn)物可通過切割分離到滴定板的每個(gè)孔中,就使得每個(gè)孔均含有一個(gè)單獨(dú)的化合物。使用連在針上的多肽進(jìn)行生物活性測(cè)定時(shí),可與多種靶分子進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),操作可反復(fù)進(jìn)行多達(dá)幾十次。多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結(jié)尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類有機(jī)小分子化合物庫。目前該技術(shù)正向著高負(fù)載量、多種官能團(tuán)化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學(xué)反應(yīng)方向發(fā)展。在先期為抗原位點(diǎn)研究進(jìn)行的多肽合成中,多針合成法產(chǎn)生了非常大的影響,已成為最有價(jià)值的組合化學(xué)合成技術(shù)的標(biāo)志。1.2茶葉袋法(Tea-bag)茶葉袋法是Houghten教授1986年發(fā)明的一種組合合成技術(shù)。該技術(shù)自使用以來,對(duì)探明激素分子活性片段有關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究、對(duì)蛋白質(zhì)片斷構(gòu)象的探察以及對(duì)RGD肽類似物的深入研究都顯示了很大的功效。該方法的固相載體為常見的Merrifield聚苯乙烯樹脂,反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸約為15mm22mm,茶葉袋網(wǎng)眼74um,可防止樹脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫,節(jié)省時(shí)間和工作量,在相同的化學(xué)反應(yīng)步驟中,每一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)可容納多個(gè)袋子,同時(shí)進(jìn)行相同的反應(yīng),集中進(jìn)行洗滌、脫保護(hù)和中和。再集中切除樹脂珠。根據(jù)茶葉袋的尺寸和樹脂珠的質(zhì)量,化合物庫每個(gè)產(chǎn)物的產(chǎn)量大約為7-15mg,多的可達(dá)100mg。使用這種集中進(jìn)行共同反應(yīng)步驟的方法,在制備肽庫時(shí)大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。1.3點(diǎn)陣法該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。以纖維素為基質(zhì)的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時(shí)避免出現(xiàn)非特異性蛋白結(jié)合的副作用。但其缺點(diǎn)是不耐受強(qiáng)酸環(huán)境,僅適合Fmoc保護(hù)方式的構(gòu)件。該合成反應(yīng)操作簡(jiǎn)便,雖無制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規(guī)模固定化多肽合成技術(shù)相媲美。點(diǎn)陣法多肽庫的合成已用于對(duì)人體巨細(xì)胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗(yàn)。點(diǎn)陣法斑點(diǎn)合成技術(shù)操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點(diǎn)的位置,使斑點(diǎn)布滿一張紙面而又不發(fā)生重疊。這些斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同的多肽,可以用鉛筆標(biāo)記斑點(diǎn)。將結(jié)合分子接到紙上后,對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)滴加相應(yīng)高濃度的氨基酸活化酯溶液,經(jīng)洗滌-脫保護(hù)-再洗滌處理,完成一個(gè)構(gòu)件的縮合。如此反復(fù)操作進(jìn)行多肽的合成。用溴酚藍(lán)指示劑給紙片染色,通過觀察由藍(lán)到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。1.4光印法(Light-directedparallelsynthesis)也稱超大規(guī)模固定化多肽合成(verylargescaleimmobilizedpeptidesynthesis,VLSIPS)。光印法是將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,其關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)光不穩(wěn)定的保護(hù)基通過特殊位置的光照會(huì)選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達(dá)5萬的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫。并且每種特定產(chǎn)物序列占據(jù)空間的一個(gè)特定區(qū)域。由于篩選是連在載體上進(jìn)行,經(jīng)熒光顯色篩選識(shí)別出有生物活性化合物的結(jié)構(gòu),可由其所在位置得到確認(rèn),合成十分精確。該合成技術(shù)已用于內(nèi)啡肽的抗體合成篩選試驗(yàn)。2裂分合成法(split-pollsynthesis)亦稱混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-beadone-product,OBOP)。裂分合成法是最早也是至今應(yīng)用最廣泛的一種高通量組合合成技術(shù)。該法只需幾個(gè)反應(yīng)器即可構(gòu)成一個(gè)容量龐大的化合物庫,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技術(shù)為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了充足的化合物資源,改變了傳統(tǒng)的單一合成/單一篩選的藥物研究格局。裂分合成法只需幾個(gè)反應(yīng)器就可以產(chǎn)生一個(gè)化合物庫,圖2例示了三個(gè)構(gòu)建單元通過三步反應(yīng)的裂分合成。具體操作是,將固相載體樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,每一部分放在單獨(dú)的反應(yīng)器中,各部分獨(dú)自與不同的構(gòu)建單元A、B和C反應(yīng),這樣每一個(gè)樹脂珠就連接上了一個(gè)構(gòu)建單元。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)完成后,將每個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,并混合每一個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠成均等的三部分,爾后集中在一個(gè)器皿中進(jìn)行常規(guī)的沖洗和脫保護(hù)程序。然后將每一部分樹脂珠放在單獨(dú)反應(yīng)器中獨(dú)自與