,中國人禽流感（H5N1）病例的 實驗室診斷及結(jié)果分析,2007年流感培訓(xùn) 中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所 國家流感中心,全球人禽流感（H5N1）病例數(shù),Total number of cases includes number of deaths. WHO reports only laboratory-confirmed cases.,16 August 2007,呼吸道標(biāo)本的采集 血清標(biāo)本的采集 組織標(biāo)本的采集 消化道標(biāo)本的采集,第一部分 檢測標(biāo)本的采集,人禽流感病例呼吸道標(biāo)本的采集,鼻拭子 鼻咽拭子 鼻咽吸取物 鼻洗液 咽洗液 氣管吸取物 氣管肺灌洗液,人禽流感病例呼吸道標(biāo)本的采集,盡量采集深部呼吸道標(biāo)本 肺穿刺液 深部吸取液,血清標(biāo)本的采集,采集急性期和恢復(fù)期血清； 急性期血清應(yīng)該在病人發(fā)病后立即采集，一般不要超過7天，如果沒有采集到7天內(nèi)血清，在能夠采集的時候立即采集； 恢復(fù)期血清在病人發(fā)病后2-3周采集，如果病人死亡，在死亡前應(yīng)采集一份血清； 病人恢復(fù)后應(yīng)定期采集血清； 采集血清時不能少于5ml； 最好采集全血和血清標(biāo)本。,組織標(biāo)本的采集,肺活檢組織 尸檢組織，尸檢組織標(biāo)本應(yīng)盡可能采集各種器官組織，在采集過程中應(yīng)盡可能避免交叉污染，每種尸檢組織標(biāo)本可分為兩部分，一部分立即用于病毒的分離檢測，如果不能馬上進行，應(yīng)該保存于-70oC；另外一部分保存于福爾馬林中，用于病理的研究。,消化道標(biāo)本的采集,糞便標(biāo)本 特別是有腹瀉癥狀的糞便標(biāo)本 PBS 或者細(xì)胞培養(yǎng)液 加入以下抗菌素和0.5%BSA -氨芐青霉素 (2 x 106 IU/litre) - 鏈霉素 (200 mg/litre) - 多粘菌素 B (2 x 106 IU/litre) - 慶大霉素 (250 mg/litre) - 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/litre) - 鹽酸氧氟沙星 (60 mg/litre), and - sulfamethoxazole (0.2 g/litre),標(biāo)本的保存和運輸,用于病毒分離的標(biāo)本應(yīng)保存于4oC,并且立即送往實驗室進行接種，如果在48小時內(nèi)不能進行接種，應(yīng)該保存于-70oC；標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)的凍融（降低分離率）； 血清標(biāo)本可以在4oC保存7天，否則應(yīng)保存于-20oC； 標(biāo)本的保存和運輸應(yīng)遵守國家生物安全的相關(guān)規(guī)定。,任何成功的流感大流行的準(zhǔn)備都依賴于對新出現(xiàn)毒株的正確的診斷。 對于可能是A型流感病毒的每個樣品最初的實驗室檢測應(yīng)該快速并且能夠排除其它常見的呼吸道病毒感染。最理想檢測方法是24小時內(nèi)能出結(jié)果。,第二部分：H5N1檢測方法的建立,符合以下標(biāo)準(zhǔn)之一的病例可以診斷為疑似或可能的H5N1病例 H5N1 病毒分離陽性。 兩種不同的引物針對不同的片段檢測H5病毒的PCR結(jié)果為 陽性。 微量中和實驗恢復(fù)血清(發(fā)病后2-4周)比急性期血清(發(fā)病后7日內(nèi)) H亞型抗體滴度升高4倍或以上， 且恢復(fù)期的血清的微量中和抗體滴度在1:80以上。 單份恢復(fù)期血清(癥狀出現(xiàn)后的14天或以后)的微量抗體滴度在1:80或 以上,這以陽性結(jié)果采用不同的血清學(xué)方法可以驗證,如馬血球?qū)嶒災(zāi)种茖嶒灴贵w滴度在1:160 以上或 H5特異的 westerblot 檢測結(jié)果陽性。,確認(rèn)人禽流感病例(notify WHO),H5N1病毒的檢測方法,2005年以來中國人禽流感病例的實驗室診斷結(jié)果,2005年以來中國人禽流感病例的實驗室診斷結(jié)果（續(xù)）,RT-PCR技術(shù)的建立,臨床標(biāo)本的RT-PCR檢測,Real-time PCR 靈敏度檢測,臨床標(biāo)本的Real-time PCR檢測,Luminex xMAP technology,MDD 對呼吸道病毒的診斷,MDD對流感病毒亞型的鑒別,1號為氣管吸取物標(biāo)本,一臨床病例的MDD檢測結(jié)果,NASBA H5N1 標(biāo)本的檢測結(jié)果,NASBA 與Real-time RT-PCR敏感性的比較,NASBA技術(shù)的特點,NASBA 技術(shù), 與Real-PCR 方法靈敏度相當(dāng)。 NASBA 技術(shù)操作簡便，而且是一種高通量的方法。 與PCR 的產(chǎn)物DNA 分子不同，RNA 分子不易對實驗儀器和環(huán)境造成污染。,血清學(xué)檢測方法,HI( HRBC) ELISA SRH MN,HI assay,不同種屬 紅細(xì)胞HI實驗的比較,RBC,Serum (USCDC),Serum (CNIC),Chicken,Turkey,Horse,160,160,160,320,5120,5120,H5 HI titer using different red blood cell,Antigen: A/chicken/hunanxiangtan-he/21/2005(H5N1)(provided by HARBIN Veterinary Research Institute ) Serum: HS: Chicken serum from HARBIN Veterinary Research Institute USCDC: goat serum from USCDC,HI(HRBC) assay,使用U型板 4 代替室溫孵育。 每次病毒的滴度要回滴 馬血球要新鮮采集，一周內(nèi)使用。,SRH原理示意圖,SRH 實驗的優(yōu)化,最適的抗原濃度是常規(guī)血凝板滴定 的1000 HAI。 1% agarose。 雞血球更適合于SRH實驗中的溶血圈的產(chǎn)生。,SRH技術(shù)的特點,簡便、可靠、重復(fù)性好、特異性強、敏感性高，不受血清中非特異性抑制素影響。 血清用量少, 并不必進行稀釋。 可對大量血清標(biāo)本進行測定。 一般實驗室均可開展，特別適用于我國基層地區(qū)。,單擴溶血的特異性對H5N1 患者血清的測定,微量中和實驗 (MN）的特點,微量中和實驗 是診斷人感染禽流感的最好的血清雪方法。 敏感性高。 特異性強( strain selection) 。 每次實驗要設(shè)病毒和細(xì)胞對照，病毒要回滴,MN assay of confirmed human cases,第三部分: 檢測結(jié)果和分析,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by HI assay,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by MN assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay using chicken serum,South China,North China,Viet Nam,Antigenic assay of human H5N1 isolates By MN assay using confirmed human case serum,case1 is a survived confirmed human H5N1 case from Anhui province(southern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset. #Case 2 is a survived confirmed human H5N1 case from Liaoning province(northern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset.,Human H5N1 confirmed cases in mainland of china since Nov,2005,death(15),survival(9),China CDC,Clade 1,Clade2.1,Clade2.3,Clade 2.2,HA Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method using the Mega3.1 program and the boottrap value 1000, the result showing the relationships of HA genes of representative influenza A H5N1 virus from different regions. The red dots denote viruses isolated from humans in China; green dots denote viruses isolated from Viet Nam and were recommended as vaccine strains by the WHO.,NA,PB2,PB1,NP,NS,PA,M,Receptor Specificity (HA 226-228),Drug surveillance (M2 inhibitor drugs),Drug surveillance ( NA inhibitor drugs),HA connecting peptide,WHO recommended candidate H5N1 vaccine viruses for potential use as pre-pandemic vaccines,A/Hongkong/213/03 A/Vietnam/1194/04 A/Vietnam/1203/04 A/Indonesia/5/2005 A/BHG/QH/1A/2005 A/WPS/Mongolia/244/2005 A/Turkey/Turkey/1/2005 A/AH/1/2005,中國目前流行的人 禽流感病毒的特征,所有的基因序列特征均是禽源的，沒有發(fā)現(xiàn)禽流感病毒與人流感病毒重組或重配的證據(jù)； 所有病毒的受體特異性和血凝素抗原連接肽特性仍然是禽源的，與人流感病毒不同；,中國目前流行的人 禽流感病毒的特征,與我國禽中分離的病毒高度同源，因此推測目前我國人的感染仍然來自于禽及其污染環(huán)境中循環(huán)的禽流感病毒； 流行毒株的情況遠(yuǎn)比我們想象的復(fù)雜，我國南方和北方流行毒株不同，南方不同的地區(qū)流行毒株不同。 所有病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物如達(dá)菲仍然是敏感的，只有2007年一株病毒M2基因分析是對金剛烷胺類藥物耐藥的，其它毒株還對該類藥物敏感。,對疾病預(yù)防控制的意義,對檢測工作的影響 在檢測過程中要充分考慮毒株差異對檢測結(jié)果的影響。 對疫苗的研制工作的影響 如何選擇合適的疫苗株？ 對臨床治療的影響 烷胺類藥物和神經(jīng)氨酸酶抑制類藥物從目前的結(jié)果看來是有效的,建立檢測方法的質(zhì)量控制體系,與中國藥品生物制品檢定所合作建立以下參考品 核酸檢測陽性參比品的建立 滴定好的病毒：103-10-5TCID50