新城疫病毒抑制肝星狀細(xì)胞活化的初步研究李亞琳渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陜西渭南714099摘要：目的探討新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）在活化肝星狀細(xì)胞（Hepaticstellatecell,HSC）中的復(fù)制對(duì)HSC的活化增殖以及細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法用不同滴度的NDV溶瘤株Italien（NDV-Italien）感染經(jīng)transforminggrowthfactor-1(TGF-1)刺激活化的人肝星狀細(xì)胞系LX-2，MTT法檢測(cè)NDV對(duì)細(xì)胞增殖率的影響。免疫熒光顯微鏡技術(shù)檢測(cè)活化標(biāo)志物-SMA的表達(dá)變化。結(jié)果NDV的感染抑制了LX-2細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖率和病毒滴度呈負(fù)相關(guān)。與未刺激組相比，NDV在TGF-1刺激的LX-2細(xì)胞中的增殖抑制率提高，LX-2細(xì)胞的活化標(biāo)志物-SMA的表達(dá)顯著性下調(diào)。結(jié)論NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制具有抑制細(xì)胞增殖和HSC活化的作用。關(guān)鍵詞：新城疫病毒；肝星狀細(xì)胞；TGF-1ApreliminarystudyofNewcastlediseasevirusrepressingtheavtivationofhepaticstellatecellYalinLiCollegeofChemistryandLifeScience,WeinanTeacherUniversity,Weinan,Shaanxi,China,714099Abstract:AimToexploretheinfluenceofNDVreplicationonLX-2cellsonthecellviabilityandbehaviorofcellularbiology.MethodsTransforminggrowthfactor-1(TGF-1)-stimulatedLX-2cellswereinfectedbydifferenttitresofoncolyticNDV-Italien,theproliferationrateofLX-2cellswasdetectedbyMTTassay.Immunofluorescenttechniquewasusedtodetecttheexpressionofactivationmarkers-SMAinLX-2cells.ResultsNDVinfectioninLX-2cellsrepressedthecellproliferationinadose-dependentmanner.Comparedwithcontrol,thegrowthinhibitionrateofactivatedLX-2cellswasincreased,theexpressionofactivationmarkers-SMAofLX-2cellsweredown-regulateddramaticlly.ConclusionThereplicationofNDVinactivatedLX-2cellsrepressesthecellproliferationandattenuatedtheactivationofLX-2cells.Keywords:Newcastlediseasevirus；hepaticstellatecell；TGF-1基金項(xiàng)目：陜西省教育廳資助項(xiàng)目（新城疫病毒抑制肝星狀細(xì)胞活化的體內(nèi)外研究），（項(xiàng)目編號(hào)：009JK427）；渭南師范學(xué)院基金資助項(xiàng)目（新城疫病毒抑制小鼠肝纖維化的機(jī)制研究），（項(xiàng)目編號(hào)：10YKZ054）作者單位：714000陜西省渭南市，渭南師范學(xué)院作者簡介:李亞琳，女，博士，副教授，主要從事腫瘤生物治療研究Email：；通訊地址：陜西省渭南市朝陽路西段渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，聯(lián)系電話：2133096，手機(jī)星狀細(xì)胞（HSC）活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。免疫組化研究顯示，肝癌合并肝硬化中活化的HSC數(shù)量顯著增高，而肝癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也具有促進(jìn)HSC活化并增殖的作用1；活化HSC和癌變細(xì)胞的相互作用會(huì)進(jìn)一步加重肝癌合并肝硬化程度。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科。由于多數(shù)RNA病毒具有天然地在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)，近年來用這類病毒作為新型運(yùn)載工具在腫瘤基因治療方面引起了人們的關(guān)注2，3。而我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了NDV也能夠在活化的HSC中復(fù)制?；谶@個(gè)研究基礎(chǔ)，本研究通過測(cè)定細(xì)胞增殖以及-SMA的表達(dá)，證明了NDV在活化的HSC中的復(fù)制對(duì)HSC的增殖以及活化標(biāo)志蛋白-SMA的表達(dá)的抑制作用，從而為以肝星狀細(xì)胞為靶點(diǎn)的肝癌合并肝纖維化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料1.1細(xì)胞與病毒人肝星狀細(xì)胞系LX-2，美國MountSinai醫(yī)學(xué)院ScottL.Friedman教授饋贈(zèng)；溶瘤株NDV-Italien由德國癌癥研究中心VolkerSchirrmacher教授饋贈(zèng)。1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基購于美國Hycolon；新生牛血清購于中國杭州四季青公司；重組人TGF-1購于以色列PeproTechAsia；鼠抗人-SMA一抗購于英國Abcam；羊抗鼠偶聯(lián)AlexaFluor594IgG二抗購于美國Invitrogen。2方法2.1MTT檢測(cè)NDV感染對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響LX-2細(xì)胞以5103cells/孔接種在96孔板中培養(yǎng)24h,然后換以0.5%小牛血清的DMEM饑餓24h。然后用2ng/ml的TGF-1（W/V,用含2%NBCS的DMEM配制）刺激LX-2細(xì)胞24h，以不同滴度的NDV感染細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)NDV對(duì)細(xì)胞增殖的影響。2.2免疫熒光檢測(cè)NDV感染后-SMA在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)LX-2細(xì)胞以1105cells/孔接種在6孔板中（預(yù)鋪蓋玻片）。培養(yǎng)24h后，用NDV-Italien（1:400稀釋）感染細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，進(jìn)行-SMA的免疫熒光檢測(cè)，步驟如下：PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min；0.1%的TritonX-100(用PBS配)滲透5min；PBST（含0.2%Tween-20的PBS）洗2次后，用5%的羊血清室溫封閉20min；直接加入鼠抗人-SMA一抗（1:50稀釋），37孵育1h；PBST洗3次后，加入偶聯(lián)AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗（1:800稀釋），37避光孵育30min；PBST洗2次后，用DAPI(1:5,000稀釋)染核2min；PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察-SMA在細(xì)胞中的表達(dá)。2.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用三個(gè)獨(dú)立樣本的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差來表示(xs)，用獨(dú)立t檢驗(yàn)（independentStudentsst-test）來分析不同組之間的差異顯著性，顯著性界限定為P0.05（雙尾）。所有結(jié)果通過SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來完成。3結(jié)果3.1NDV抑制LX-2細(xì)胞的增殖LX-2細(xì)胞會(huì)隨著傳代培養(yǎng)而自發(fā)活化4。為了考查NDV對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖影響，試驗(yàn)用不同稀釋濃度的NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細(xì)胞以及用2ng/mlTGF-1刺激活化的LX-2細(xì)胞，并用MTT方法檢測(cè)NDV對(duì)兩組細(xì)胞增殖影響。如圖1所示，LX-2細(xì)胞無論是在未刺激狀態(tài)還是刺激后的活化狀態(tài)，NDV均可以抑制細(xì)胞的增殖（A），且具有劑量依賴性。但是NDV對(duì)2ng/mlTGF-1刺激活化細(xì)胞的增殖抑制率更高（B），與未刺激組相比具有顯著性差異（P0.05）。ThedilutionofNDVThedilutionofNDV圖1NDV對(duì)LX-2細(xì)胞生長的抑制作用。LX-2細(xì)胞經(jīng)2ng/mlTGF-1預(yù)刺激后，再用NDV-Italien感染24h。MTT檢測(cè)細(xì)胞在490nm時(shí)的吸光度值（A），并計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率（B）。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立檢測(cè)的平均值(xs)。Figure1TheproliferationofLX-2CellswasinhibitedbyNDV.LX-2cellswerepretreatedwith2ng/mlTGF-1,theninfectedwithNDV-Italienfor24h.CellproliferationwasdetectedusingMTTassayatwavelengthof490nm(A)andcellgrowthinhibitionratewascalculated(B).Datarepresentthemeansoftriplicate.3.2NDV抑制LX-2細(xì)胞的-SMA表達(dá)試驗(yàn)用NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中-SMA的表達(dá)。結(jié)果顯示，在NDV感染前，LX-2細(xì)胞中有較強(qiáng)的-SMA表達(dá)（圖2A）；而NDV感染后，細(xì)胞中-SMA的表達(dá)明顯消失（圖2B）。圖2LX-2細(xì)胞中-SMA的表達(dá)。LX-2細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)24h，用NDV-Italien感染細(xì)胞。24h后，細(xì)胞被固定、滲透，羊血清封閉后加入鼠抗人-SMA一抗，37孵育1h。加入偶聯(lián)AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗，37孵育30min。用DAPI染核后，熒光顯微鏡觀察-SMA的表達(dá)。NDV感染前（A）；NDV感染后（B）。（放大倍數(shù)400）Figure2Theexpressionof-SMAinLX-2cells.LX-2cellswereinoculatedin96-wellplatesandculturedfor24hfollowedbyinfectionwithNDV-Italien.After24h,thecellswerefixed,permeabilized,blockedbygoatserumandincubatedwithmouseanti-human-SMAantibodyat37for1h.ThensectionswereincubatedwithAlexaFlour594goatanti-mouseIgGsecondaryantibodyfor30minat37C.AfterstainedthenucleuswithDAPI,-SMAexpressionwerevisualizedunderafluorescencemicroscope.BeforeNDVinfection(A)；AfterNDVinfection(B).(Magnification400)4討論活化HSC高表達(dá)-SMA，所以-SMA已經(jīng)被用作判斷HSC活化以及纖維化發(fā)展的標(biāo)志5。而在HSC活化以及肝纖維化過程中，TGF-1無疑是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，是HSC活化的一個(gè)關(guān)鍵因素6。TGF-1能夠促進(jìn)HSC由星狀的靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)型為成肌纖維細(xì)胞樣的活化狀態(tài)，誘導(dǎo)HSC活化并產(chǎn)生過量的ECM進(jìn)而形成肝纖維化7,8。HSC活化以及肝纖維化的發(fā)生與肝癌發(fā)生也有密切的關(guān)系。國內(nèi)幾個(gè)報(bào)道均用免疫組化證明了肝癌組織中活化的HSC明顯高于正常組織9,10；體外實(shí)驗(yàn)證明HSC在肝癌的血管生成中起主要作用11。有文獻(xiàn)報(bào)道大鼠的肝癌細(xì)胞能促進(jìn)HSC的募集和活化12；而肝臟損傷后病變的肝細(xì)胞也能誘導(dǎo)HSC的活化13。因此，肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，活化的肝星狀細(xì)胞和病變的肝細(xì)胞相互作用，共同促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)程，而靶向HSC的抗纖維化治療也成為阻止肝癌發(fā)生的有效途徑之一14,15。我們以前的實(shí)驗(yàn)也證明了TGF-1具有促進(jìn)HSC活化作用，并且用不同方法證實(shí)了NDV能夠在活化LX-2細(xì)胞中高效復(fù)制。本試驗(yàn)通過進(jìn)一步的研究工作探討NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制對(duì)細(xì)胞的增殖以及活化功能的影響，證明了NDV在活化HSC中的復(fù)制能夠抑制該細(xì)胞的增殖及活化，并降低細(xì)胞內(nèi)一些活化相關(guān)基因的表達(dá)。MTT方法證明，LX-2細(xì)胞無論是否被TGF-1預(yù)刺激，NDV均劑量依賴性地抑制細(xì)胞的增殖。TGF-1刺激后，細(xì)胞在490nm的吸光度值和計(jì)算所得的生長抑制率總體高于未刺激組，說明TGF-1的刺激誘導(dǎo)了LX-2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的活化。而當(dāng)NDV感染后，其在TGF-1刺激活化的LX-2細(xì)胞的復(fù)制率更高，從而對(duì)細(xì)胞生長抑制率也比為刺激組高。這個(gè)結(jié)果表明NDV更容易在刺激活化的細(xì)胞中復(fù)制而引起更高的細(xì)胞死亡率，即NDV的復(fù)制效率越高，對(duì)細(xì)胞的生長抑制率也越高，對(duì)細(xì)胞活化的抑制也更加有效。為了證明NDV的復(fù)制能夠抑制HSC的活化，本試驗(yàn)檢測(cè)了NDV感染對(duì)LX-2細(xì)胞中的-SMA表達(dá)的影響。同預(yù)期結(jié)果一樣，NDV感染后-SMA表達(dá)明顯消失。說明NDV的復(fù)制確實(shí)很大程度地降低了LX-2的活化程度。NDV能在活化HSC中相對(duì)高效地復(fù)制，進(jìn)而抑制細(xì)胞的活化功能。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：NDV在活化HSC中的復(fù)制，能夠抑制HSC的增殖以及活化相關(guān)蛋白的表達(dá)，很大程度地抑制了HSC的活化功能。該結(jié)果為將NDV進(jìn)一步用于抑制肝纖維化以及肝癌治療提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1NhieuJT,BrochriouI,PrauxAM,etal.Myofibroblastsandhepatocellularcarcinoma:aninvivoandinvitrostudyJ.JHepatol,1998,29:120-128.2BianH,FournierP,PeetersB,etal.Tumor-targetedgenetransferinvivoviarecombinantNewcastlediseasevirusmodifiedbyabispecificfusionproteinJ.IntJOncology,2005,27(9):377-384.3BianH,FournierP,MoormannR,etal.SelectivegenetransfertotumorcellsbyrecombinantNewcastleDiseaseVirusviaabispecificfusionproteinJ.IntJOncol,2005,26(3):431-439.4XuL,HuiAY,AlbanisE,etal.Humanhepaticstellatecellline,LX-1andLX-2:newtoolsforanalysishepaticfibrosisJ.Gut,2005,54:142-151.5AkpolatN,YahsiS,GodekmerdanA,etal.Thevalueof-SMAintheevaluationofhepaticfibrosisseverityinhepatitisBinfectionandcirrhosisdevelopment:ahistopathologicalandimmunohistochemicalstudyJ.Histopathology,2005,47:276-280.6ChangXM,ChangY,JiaA.Effectsofinterferon-alphaonexpressionofhepaticstellatecellandtransforminggrowthfactor-beta1andalpha-smoothmuscleactininratswithhepaticfibrosisJ.WorldJGastroenterol,2005,11:2634-2636.7BreitkopfK,GodoyP,CiuclanL,etal.TGF-/smadsignalingintheinjuredliverJ.ZGastroenterol,2006,44:57-66.8BreitkopfK,HaasS,WiercinskaE,etal.Anti-TGF-betastrategiesforthetreatmentofchronicliverdiseaseJ.AlcoholClinExpRes,2005,29:121S-31S.9呂麗,王莉芬,王麗麗,等.肝星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞生長因子與肝癌相關(guān)性研究J.肝臟,2005,10:213-214.10王偉,官陽,楊木蘭,等.活化肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性J.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2007,23:492-494.11JungJO,GwakGY,LimYS,etal.Roleofhepatic