PCR技術(shù)及應(yīng)用,生物化學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展,目錄,PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的類型PCR的應(yīng)用,PCR可以在3小時(shí)內(nèi)把特定的基因指數(shù)放大,染色體,神奇而又簡(jiǎn)單的PCR,PCR：PolymeraseChainReaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR技術(shù)的創(chuàng)建,一、最初的理論描述KhoranaKhorana(1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可合成tRNA基因。”但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒(méi)有實(shí)際意義。加上70年代初分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了,二、PCR技術(shù)的發(fā)明KaryMullis1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCRMullis要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開(kāi)車(chē)去鄉(xiāng)下別墅的路上,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,PCR從構(gòu)想成為現(xiàn)實(shí)1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片段；1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開(kāi)始學(xué)習(xí)PCR的方法。,有關(guān)PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)體系PCR過(guò)程PCR的基本原理,有關(guān)PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的基本原理,有關(guān)PCR反應(yīng),94,55,37,?,三、PCR技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)，大大提高了PCR的效率。,TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus),酶活性(%),溫度(),405060708090100,10080604020,Saiki,1988年,PCR技術(shù)的發(fā)展,72,94,55,PCR循環(huán),三、PCR技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展1988年第一臺(tái)PCR儀問(wèn)世，PCR逐步實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化1989年美國(guó)Science雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年。1993年，Mullis因此項(xiàng)技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,KaryB.Mullis（1944）,karymullis,PCR儀的變遷,三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng)（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊自來(lái)水冷卻（PE，1988）電加熱塊內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊機(jī)械手（Strategene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendorf）空氣加熱(Roche)梯度PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Lab-on-chip式的PCR儀(芯片PCR),全新4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,普通PCR儀、梯度PCR儀,PCR技術(shù)的原理,無(wú)細(xì)胞分子克隆法：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過(guò)不斷重復(fù)這一過(guò)程，可以使目的DNA片段得到擴(kuò)增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使DNA的合成量呈指數(shù)型增長(zhǎng)。,1stcycle,2ndcycle,3rdcycle,過(guò)程,變性,退火,延伸,經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）,9430s5545s721min,945min,30次,727min,4forever,PCR技術(shù)的特點(diǎn),靈敏度高30輪循環(huán),擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）將模板從皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)PFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌特異性強(qiáng)引物序列與模板結(jié)合的特異性快速簡(jiǎn)便一次性加好反應(yīng)液，24小時(shí)即可完成擴(kuò)增,1）不對(duì)稱PCR2)反向PCR3）多重PCR4）LP-PCR5）錨定PCR6）PCR固相分析法7)原位PCR8）逆轉(zhuǎn)錄PCR9）熒光定量PCR,PCR的類型,目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,1.不對(duì)稱PCR,高濃度引物,低濃度引物,2.反向PCR(reversePCR),用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,3.多重PCR（復(fù)合PCR）,在同一PCR反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中幾個(gè)不同靶區(qū)域的DNA片段，這一過(guò)程稱為多重PCR?？捎糜跈z測(cè)特定基因序列的大小、缺失、突變是否存在。,電泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人類肌營(yíng)養(yǎng)不良基因,A：無(wú)外顯子8,12,17,19對(duì)應(yīng)條帶,說(shuō)明病人外顯子819缺失,B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者,C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式,多重PCR檢測(cè)DMD基因缺失,4.LP-PCR（Labelledprimers),利用同位素、熒光素等對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測(cè)目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分,病毒1病毒2病毒3病毒4,標(biāo)記引物,觀察,PCR產(chǎn)物,5.錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段兩側(cè)的序列,對(duì)于未知序列怎么辦？,cDNA,末端核酸轉(zhuǎn)移酶,3GGGG,5,CCCC錨定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對(duì)的3錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增,6.PCR固相分析法,檢測(cè)探針信號(hào),可用于基因芯片的制作,7.原位,原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列,既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái),成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。,原位PCR的作用,操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,A.陽(yáng)性對(duì)照,B.陰性對(duì)照,C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá),8.,逆轉(zhuǎn)錄酶,聚合酶,mRNA,cDNA,雜化雙鏈,PCR擴(kuò)增,基因,mRNA,蛋白質(zhì)多肽鏈,熒光定量PCR通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。,9.熒光定量,熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBRGreenI序列特異性探針TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特異性探針Amplifluor(Intergen),SYBR-GreenI,SYBR-GreenI,TaqmanProbe,X,分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）,熒光定量PCR與普通PCR的比較實(shí)時(shí)在線監(jiān)控對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合,提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無(wú)需跑膠,熒光定量PCR儀,普通PCR儀,PCR的應(yīng)用領(lǐng)域,生物學(xué)基礎(chǔ)研究目的基因擴(kuò)增和鑒定；DNA序列測(cè)定；定點(diǎn)突變；基因表達(dá)分析醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用遺傳疾病基因診斷；致病病原體檢測(cè)；癌基因檢測(cè)；器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)物證鑒定個(gè)體識(shí)別；親子鑒定其他動(dòng)、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)）；生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究；分子考古學(xué)（恐龍DNA分析）等,分子克隆（目的基因的獲取和鑒定）,PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究,5,5,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,PCR(5端引入限制酶識(shí)別位點(diǎn)),PBSgroup,K5group,*,K5通過(guò)抑制腫瘤血管新生抑制肝癌生長(zhǎng)（RT-PCR技術(shù)獲得K5基因）,PBSK5,PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究,YangX,etal.CancerBiology&Therapy,2019.GuX,YangX*,etal.Apoptosis.2019LiL,YangX*,etal.JBiolChem.2019.,圍繞二硫鍵構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的K5缺失突變體（PCR缺失突變）,PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究,YangX,etal.JournalofCellularandMolecularMedicine,2019LiC,YangX,etal.Cornea.2019,臨床基因診斷,A,內(nèi)源性病變基因,正常人,A,病人,PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè),遺傳疾病的基因診斷,基因缺失、插入或置換等,地中海貧血,珠蛋白鏈合成不平衡,PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè),A,正常人,病人,正常,病人,A,病原微生物基因,正常人(-),病人(+),PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè),登革病毒的檢測(cè),登革病毒基因檢測(cè),1：Marker2：陽(yáng)性模板3：待測(cè)樣品14：已確診乙肝病人樣品5:待測(cè)樣品26:待測(cè)樣品37:陽(yáng)性模板,乙肝病毒基因檢測(cè),陰性,陰性,基因檢測(cè)在乙肝診療各階段的應(yīng)用,藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療（療效評(píng)價(jià)）,前C區(qū)1896位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒,跟蹤隨訪,乙肝病毒定量檢測(cè)試劑盒,確診,病毒學(xué)分析,乙肝病毒分型檢測(cè)試劑盒,拉米夫定耐藥檢測(cè)試劑盒,阿德福韋耐藥檢測(cè)試劑盒,共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測(cè)試劑盒,恩替卡韋耐藥檢測(cè)試劑盒,PCR-RFLP法：(PCR產(chǎn)物限制性酶切片斷多態(tài)性分析),Ras癌基因,限制性內(nèi)切酶,PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè),突變,限制性內(nèi)切酶,正常,突變,電泳,法醫(yī)學(xué)物證鑒定,個(gè)體識(shí)別；親子鑒定方法：PCR-RFLP（限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性）DNA指紋PCR-ASO（等位基因特異性寡核苷酸）PCR-VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列）多態(tài)性PCR-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）多態(tài)性PCR-SS