大鼠彌漫性腦損傷后早期 c-fos 基因表達(dá)的法醫(yī)學(xué)研究 大鼠彌漫性腦損傷后早期 c-fos 基因表達(dá)的法醫(yī)學(xué)研究 【摘 要】 目的 觀察大鼠彌漫性腦損傷后 c f0s 基因表達(dá)的規(guī)律。方法采用 marmarou 的彌漫性腦損傷模型，分別于傷后 15 min， 30min，lh， 3h， 6h， 12h， 24h 取腦組織，運(yùn)用免疫組化 sabc 法觀察 c fos基因的表達(dá)。結(jié)果 打擊后 15 min 時(shí)，即可觀察到 c fos 基因的表達(dá)， 1 h 后表達(dá)明顯增加， 3 h 達(dá)到高峰，隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少， 24 h 可見少量表達(dá)。表達(dá)呈 彌漫性，以皮層、腦干最為明顯，不同部位的變化趨勢(shì)一致。對(duì)照組未見陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞 結(jié)論 c fos 基因的表達(dá)規(guī)律可用于彌漫性腦損傷的早期鑒定及損傷經(jīng)過時(shí)間的推斷【關(guān)鍵詞】彌漫性腦損傷； c fos 基因；免疫組織化學(xué)；嗜銀染色；損傷經(jīng)過時(shí)間【中圖分類號(hào)】 r36【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 a【文章編號(hào)】 1007 9297(2005)01 0042 03study on the expression of c-fos gene in the early stage of difuse brain injury in rats and its forensic implication chen ren hui，l1 yo ong ， cheng li bao department offorensic pathology，wannan medical college， u 241001【 abstract】 0bjective to investigate the expression of c fos gene in diffuse brain injury(dbi) methods based onmarmarou s model of dbi and took the samples at 15min， 30min， lh， 3h， 6h， 12h， 24h after brain injury the expression of c f0sgene was observed by immunohistochemical sabc results rhe expression of c-fos gene could be detected at 15min afterinjury， increased at lh and peaked at 3h positive cells decreased with the prolongation of injury time little expression wasf0und at 24h ihe expression of c fos gene was f0und in wide range but significant in cortex and brain stem ihe chan gingtendency of diferent areas was same rhe control group showed negative staining conclusion rhe c-fos gene can diagn oseand date early dbi【 key words】 difuse brain injury； c fos gene；immunohistochemistry； silver staining； injury time 腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定中最常見的損傷，彌漫性腦損傷 (diffuse brain injury dbi)作為閉合性腦損傷的一種，多見于交通事故。 c fos基因?qū)?于即刻早基因家族 (immediate early gene， iegs)，在正常情況下參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、記憶和信息傳遞過程，生理情況下不易被檢測(cè)到。當(dāng)神經(jīng)組織受到病理性刺激如腦缺血、外傷等作用后， c fos 基因快速表達(dá)， 02 因此被稱為快速反應(yīng)原癌基因。c fos 基因表達(dá)是神經(jīng)組織受傷害的早期指標(biāo)。目前有關(guān) dbi 后c fos 基因表達(dá)的文獻(xiàn)很少，作者擬采用 marmarou 的彌漫性腦損傷模型 31 初步探討大鼠 dbi 后 c fos 基因表達(dá)的規(guī)律。材料與方法一、試驗(yàn)動(dòng)物健康雄性 sd 大鼠 48 只 f 南京青龍 山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 )，體重 300 320 g，隨機(jī)分成 dbi 15min、 30min， 1 h， 3 h， 6h，12h， 24h 組及及對(duì)照組，共 8 組。每組 6 只大鼠二、模型制作采用marmarou 腦損傷模型，用 1戊巴比妥 鈉腹腔注射 (30 mg kg)，麻醉成功后，大鼠頭部做中線切口，暴露顱骨將直徑 10 mm、厚 3 mm 的打擊墊片用高分子聚脂固定于顱頂?shù)墓跔羁p與人字縫之間的中央部然后將大鼠俯臥固定已知厚度及彈性系數(shù)的海綿床上，待動(dòng)物開始蘇醒、有肢體活動(dòng)時(shí)，移至一有機(jī)塑料管下端墊片正對(duì)管中央。 450g 鐵棒從 2m 高度自管內(nèi)自由墜落至打擊墊片上立即移開海綿床以免二次損傷。三、組織處理及切片在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)處死動(dòng)物：將動(dòng)物過量麻醉后，斷頭取腦打開顱骨后迅速用 4多聚甲醛液預(yù)固定：【作者簡(jiǎn)介】陳仁輝 (1979 一 )，男，安徽寧國(guó)人，碩士，主要從事閉合性顱腦損傷的研究。聯(lián)系方式：+86 1 3855347401： e mail： wnmccrhhotmail corn 法律與醫(yī)學(xué)雜志 2005 年第 12 卷 (第 1 期 )取 大鼠全腦于 4多聚甲醛液后固定 12h沿大腦正中裂矢狀切開大腦、小腦、腦干，于正中切面左有外側(cè) 3 mm 處切取左有大腦皮質(zhì)、 腦以及腦干組織各 l 塊，分別做常規(guī)石蠟包埋，切片厚 5 m。分別作 he 染色、嗜銀染色及 c fos 免疫組織化學(xué)染色四、試劑及方法 rabbit anti c fos： dab 顯色試劑盒及 sabc 試劑盒 (武漢博士德公司 )，按說明書進(jìn)行操作。 f】 pbs取代一抗、二抗作陰性對(duì)照，以細(xì)胞核 fi{；現(xiàn)黃色產(chǎn)物為陽(yáng)性結(jié)果。硝酸銀、氯化金、硫代硫酸鈉、飽和氨水，按 glees marslands染色法進(jìn)行五、圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理高倍視野 fx400)下分別對(duì)大腦皮質(zhì)、丘腦以及腦干隨機(jī)選取 5 個(gè)視野依次 計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以其平均值作為該切片層面的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以同一動(dòng)物 6 個(gè)切片層面的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為該動(dòng)物的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 各組動(dòng)物再分別計(jì)算其組內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 spss 10 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、檢驗(yàn)。結(jié) 果一、大體及鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組可見蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦表面基本正常，無大面積挫傷或局灶性挫裂傷灶。少數(shù)動(dòng)物可見腦干有灶性出血、側(cè)腦室出血。未見腦組織局灶性病灶。鏡下可見神經(jīng)元胞體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)不清核固縮，胞漿紅染加深神經(jīng)元損害主要分布于兩側(cè)大腦皮質(zhì)。膠質(zhì)細(xì)胞腫脹明顯。細(xì)胞周圍間質(zhì)水腫。嗜銀 染色示軸索變粗、腫脹，呈串珠狀、波浪狀或螺旋狀改變 (圖1)可見軸索斷端膨大呈球形改變。二、免疫組織化學(xué)染色 dbi 后15min即可觀察到陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈散存少量分布 f 圖 2)。陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于胞核內(nèi)，胞漿內(nèi)以及大的突起根部也有表達(dá)。1 h 后表達(dá)明顯增加 (圖 3)，并于 3 h 達(dá)到高峰 (圖 4)。隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少 24h 后可見少量表達(dá)。表達(dá)呈彌漫性以皮層、腦干最為明顯，不同部位的變化趨勢(shì)一致 陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞包括神經(jīng)元及各類膠質(zhì)細(xì)胞 c los 基因表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，見表l 正常對(duì)照組大腦皮質(zhì)、丘腦以及腦干未見陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。討論彌漫性腦損傷 (diffuse brain injury dbi)是一類常見的、后果嚴(yán)重的原發(fā)性腦損傷，具有較高的致殘率 43 和病死率，在法醫(yī)學(xué)中較常見。一般認(rèn)為 dbi 主要包括彌漫性軸索損傷、彌漫性腦腫脹、缺氧性腦損害、彌漫性血管損傷等 4 種基本類型。 51 4 種病理變化?？赏瑫r(shí)存在。本實(shí)驗(yàn)采用 marmarou 的模型制作方法在鏡下可以觀察到神經(jīng)元腫脹，結(jié)構(gòu)不清，核固縮改變。細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯。軸索增粗、腫脹，斷端可見軸索球形成等。符合 dbi 的病理學(xué)改變 ，并且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，上述病理學(xué)改變逐漸加重原癌基因 c los 是 fbj 和fbr 小鼠特發(fā)性骨肉瘤 (msv)中病毒癌基因 v los 的細(xì)胞同源物。c los 原癌基 大 j 高度保守，小鼠、大鼠與人的 los 同源性分別為97和 94。人類的 c los 基因定位于第 14 號(hào)染色體 (14q) 61由 3 5kb 的 dna 片段組成，當(dāng) c los 基因被激活后迅速轉(zhuǎn)錄 mrna，然后進(jìn)入胞質(zhì)在胞質(zhì)中合成 c fos 蛋白之后較快地進(jìn)入胞核，稱為核磷酸蛋白，它由 380 個(gè)氨基酸組成其分子量為 55kb，是 dna結(jié)合蛋白 c fos 基因?yàn)樯?經(jīng)系統(tǒng)最常見的即刻早基因在外界刺激下數(shù)十分鐘內(nèi) c fos 基因即開始表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物 c fos 蛋白與c iun 基因的表達(dá)產(chǎn)物 c iun 蛋白通過 “ 亮氨酸拉鏈 ” 形成f0s-jun 異源二聚體構(gòu)成 ap 一 1 轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步激活目的基因的表達(dá)。 7】 c fos 基因的表達(dá)在創(chuàng)傷的初始應(yīng)答與繼發(fā)性病理生理改變之間可能成為重要的中介 f8 如參與了細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及繼發(fā)性顱腦損傷等。本文應(yīng)用 marmarou 的彌漫性腦損傷模型研究了 c los 基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)顯示，打擊后 15 min，腦皮層、腦干等部位中即出現(xiàn) c los 基因的表達(dá)， 1 h 后表達(dá)明顯增加， 3 h 達(dá)到高峰，整個(gè)鼠腦組織中，包括腦皮層、皮層下、丘腦、腦干等區(qū)域均呈彌漫性表達(dá)，不同部位的變化趨勢(shì)一致，而后逐漸下降， 24h 后仍可見少量表達(dá)。關(guān)于腦創(chuàng)傷后 c los 基因的表達(dá)機(jī)制據(jù)認(rèn)為是通過谷氨酸 n 一甲基一 d 一天門冬氨酸受體 (nmdar)介導(dǎo)的并隨著谷氨酸釋放增多而上升。 i 9i 谷氨酸的釋放激活神經(jīng)細(xì)胞膜nmda 受體，使受體活化而介導(dǎo) c los 基因的表達(dá) 另一種觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)元中 c los 基因的表達(dá)是由 leao 播散性抑制 (spreading depressionsd)所致。機(jī)械性損傷可以誘發(fā) sd， sd可將細(xì)胞外 ca 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞外 caz 濃度下降，引起皮層神經(jīng)元去極化。ca 內(nèi)流及神經(jīng)元去極化均可引起 c los 基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過成功復(fù)制 dbi 動(dòng)物模型運(yùn)用 he、神經(jīng)纖維特殊染色以及免疫組化技術(shù)，不僅說明 dbi 存在復(fù)雜的病理學(xué)改變同時(shí) c los 固表選的即時(shí)性 1 技 f j 問上的相對(duì)規(guī)律性也為我們?cè)缙阼b定 dbi 手 u 推斷其掘協(xié)彝過時(shí)間提供了參考，、 }；女 i1】 morgan s gr 目 #mg the regulation i ful： li-in ui d thor【 e(： s in i ⋯； ⋯； vmmui neon 1990 4( ， 7 s7l l lj i l p1 m ， ilox,cla da el g pmb r 1iiilly ind eedby dedolerkzati0n ⋯； ⋯； ⋯； lw j⋯； c b jj 皿 1 ⋯；⋯； f j 2002 11k287 395 n_b m m⋯； a 肚 w model ii dilttt brain1 ⋯； lp 蛆 morl,oloweal ch⋯； ⋯； n【 j n ，l994 f,： b： 80(21： 30i 一 313i4】 “ 譯 + imj ： mi 2 4}；j1 衄 di m l tk ⋯； jl1i f{；⋯； ji il in rp 法律 醫(yī)學(xué)雜 2005年第 l2卷 f第 1期 )aum4jl j n⋯； ld exp neuml 2 mj 641 651 嘲 ba rke r pe rohi m w n m， t h umpld ⋯；h j1 r⋯； 1|l1 【 ⋯； 14q2l 一 i j】pr nad us4i98,t 81 ： 5826-58307 k mu 璐 x⋯； jj m incmcd ⋯；of brn 凸】 1d ap l ⋯； c pllnn l0r after caiealimi,tinjury mm }；brun r i994 664fi 一 21 14l一 147kaminska b l k lru1)ui i zlductlotof ap 一 1⋯； npn0nkiu|dna hlnding aliil⋯；f n h pp j 雌 rsu ⋯；neuro i