SNP檢測技術(shù) 內(nèi)容簡介 SNP概念 SNP的概念 單核苷酸多態(tài)性 SingleNucleotidePolymorphism SNP 指由于單個核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性 在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中 絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象 即SNP 它包括單堿基的轉(zhuǎn)換 顛換 插入及缺失等形式 SNP在基因組內(nèi)的形式 一是遍布于基因組的大量單堿基變異 二是分布在基因編碼區(qū) codingregion 稱其為cSNP 屬功能性突變 SNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的 1 非轉(zhuǎn)錄序列要多于轉(zhuǎn)錄序列 2 在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義突變的頻率 比其他方式突變的頻率低得多 SNP的特點 在遺傳學(xué)分析中 SNP作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用 主要源于這幾個特點 1 密度高SNP在人類基因組的平均密度估計為1 1000bp 在整個基因組的分布達(dá)3 106個 遺傳距離為2 3cM 密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高 可以在任何一個待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記 2 富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平 因此 它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素 SNP的特點 3 遺傳穩(wěn)定性與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比 SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性 4 易實現(xiàn)分析的自動化SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型 allele 這樣在檢測時只需一個 或 全 無 的方式 而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性 微衛(wèi)星那樣對片段的長度作出測量 這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化 一 SNPs經(jīng)典檢測方法 一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法 如 1 限制性片段長度多態(tài)性法PCR RFLP 2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR SSCP 3 變性梯度凝膠電泳 denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE 4 等位基因特異性PCR allelespecificPCR ASPCR 等等 PCR RFLP方法 原理 利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點的特異性 用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷 如果存在SNP位點 酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異 根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點 特點 該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點 它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一 PCR RFLP原理圖 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 SSCP 原理 單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu) 不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率 這種二級結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成 單個堿基的改變也會影響其構(gòu)象 最終會導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上 短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象 這樣在凝膠上的遷移速率不同 出現(xiàn)不同的條帶 檢測SNP 特點 由于該方法簡單快速 因而被廣泛運用于未知基因突變的檢測 這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置 變性梯度凝膠電泳 DGGE 原理 是利用長度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理 通過梯度變性膠將DNA片段分開的電泳技術(shù) 電泳開始時 DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān) 而一旦DNA泳動到某一點時 即到達(dá)該DNA變性濃度位置時 使得DNA雙鏈開始分開 從而大大降低了遷移速率 當(dāng)遷移阻力與電場力平衡時 DNA片段在凝膠中基本停止遷移 由于不同的DNA片段的堿基組成有差異 使得其變性條件產(chǎn)生差異 從而在凝膠上形成不同的條帶 等位基因特異PCR AS PCR 原理 根據(jù)SNP位點設(shè)計特異引物 其中一條鏈 特異鏈 的3 末端與SNP位點的堿基互補 或相同 另一條鏈 普通鏈 按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計 因此 AS PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記 因為特異引物在一種基因型中有擴增產(chǎn)物 在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物 用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產(chǎn)物的有無 從而確定基因型的SNP SNPs高通量的檢測方法 另一大類檢測方法是近些年來發(fā)展起來的 高通量 自動化程度較高的檢測SNPs的方法 較為常用的有 1 DNA測序法 2 DNA芯片檢測 3 飛行質(zhì)譜儀 MALDI TOFMS 檢測 4 變性高效液相色譜 DHPLC 法等等 DNA測序法 直接測序是最容易實施的SNP檢測方法 原理 通過對不同個體同一基因或基因片段進(jìn)行測序和序列比較 以確定所研究的堿基是否變異 其檢出率可達(dá)100 特點 可以得到SNP的類型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù) 基因芯片技術(shù) Genechips 原理 是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上 待測基因經(jīng)提取 熒光標(biāo)記后 與固定好的探針進(jìn)行雜交 最后根據(jù)熒光的強度和種類測出待測序列的堿基類別 特點 基因芯片具有信息量大和自動化程度高的突出優(yōu)點 但它也存在若干問題 芯片造價高昂 所需設(shè)備貴重 不利于普及應(yīng)用 MALDI TOF 原理 是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價結(jié)合后 在硅芯片上進(jìn)行引物的退火 延伸反應(yīng) 突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同 根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測SNP 變性高效液相色譜 DHPLC 原理 目標(biāo)核酸片段PCR擴增 部分加熱變性后 含有突變堿基的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈 因包含錯配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對的同源配對區(qū)和固定相的親和力弱 更易被從分離柱上洗脫下來 從而達(dá)到分離的目的 SNPs的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異 依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基 特點 使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高 便于自動化的優(yōu)點 對未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95 以上 但DHPLC檢測對所用試劑和環(huán)境要求較高 容易產(chǎn)生誤差 不能檢測出純合突變 MassARRAY SNP分型的方法多種多樣 MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具 通過引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏 可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合 實現(xiàn)基因分型檢測 基于MassARRAY 分子量陣列平臺的iPLEXGOLD技術(shù)可以設(shè)計最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測 實驗設(shè)計非常靈活 分型結(jié)果準(zhǔn)確性高 特別適合于對全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗證 或者是有限數(shù)量的研究位點已經(jīng)確定的情況 MassARRAY技術(shù)原理 先通過PCR擴增目標(biāo)序列 然后加入SNP序列特異延伸引物 在SNP位點上 延伸1個堿基 將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強激光激發(fā) 核酸分子解吸附為單電荷離子 電場中離子飛行時間與離子質(zhì)量成反比 通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的精確分子量 從而檢測出SNP位點信息 MassARRAY技術(shù)原理 MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng) 緊挨SNP位點設(shè)計一段探針 在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP 使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止 根據(jù)SNP位點的不同 探針將結(jié)合不同的ddNTP 從而具有不同的分子量 質(zhì)譜儀即可檢測出這種分子量差異 從而實現(xiàn)SNP分型的目的 MassARRAY技術(shù)流程 應(yīng)用 1 確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系2 解釋個體間的表型差異對疾病的易感程度3 對未來疾病做出診斷4 研究不同基因型個體對藥物反應(yīng)的差異 指導(dǎo)藥物開發(fā)及臨床合理用藥5 個體間SNP千差萬別 通過SNP檢測等技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定及個體識別 優(yōu)勢 1 質(zhì)譜儀檢測的是分子最本質(zhì)的特征之一 分子量 不涉及熒光標(biāo)記 凝膠電泳等 就能檢測一個堿基的差異 準(zhǔn)確性高 機器本身出錯的概率非常低 2 質(zhì)譜儀的靈敏度非常高 檢測窗口內(nèi) 任何pmol級別的物質(zhì)都能被檢測出來 3 通量高 幾秒就能檢測完一個反應(yīng)孔 4 操作簡單 儀器要求簡單 除質(zhì)譜儀外 都是常規(guī)PCR儀器 5 靈活 每天可以完成幾個反應(yīng)